医学科研方复习资料

医学科研方法
主讲苏秀兰
细胞生物学教授
第一讲绪论
一概念：在医学科学研究活动中，运用科学的实践和理论思维的技巧，充分发挥自己的智
慧，去寻找观念世界与现实世界之间的联系或规律，从而发现新现象，提出新理论的手段。
二医学科学研究的特征与任务
主要特征
（1）医学科学与其他科学一样，具有明显的探索性，创新性，继承性，连续性
（2）构成医学科学研究的两个要素是科学实践与理论思维。
（3）医学科学研究要求有科学性，先进性，实践性和实用性。
“良好的方法能使我们更好地发挥运用天赋的才能，而拙劣的方法可能阻碍才能的发挥”
——贝尔纳
科研工作者的基本任务: 应用已知的科学知识去寻找、提出和解决科学问题
1. 揭示人体生命本质与疾病发生、发展的现象和机制；
2. 认识人与环境的相互关系；
3. 认识健康与疾病相互转化的客观规律;
4. 用理性的方法去整理感性的材料，从而为防治疾病、提高健康水平提供技术、方法和手
段
三学习医学科研方法的意义
1. 掌握正确的科研思维方法和研究工作方法
2. 使年轻的医学科技工作者快速成长，早出成果,多出成果
3. 使医学科学工作者提高科学素养,增长才干，提高科学的见识力，从而认识科学发展的主
流和趋势、前沿和远景，以恰当地安排研究工作。
第二讲医学科研道德
道德有一定的调节或左右人们行为的作用，通过道德观念可评价人们的行为和调整人
们之间的关系，也可通过教育和社会舆论的力量，使人们逐渐形成一定的信念、习惯、传统
而发生作用。
道德属于社会文化的一部分，随着社会的不断发展而不断的更新和发展；随着不同行业
的特点，产生服从社会整体道德要求的行业道德。
一. 科研道德的基础与核心
纯洁的动机、高尚的目标，对人类的责任感和事业心，以及为科技事业无私无畏的献身
精神。
（一）有崇高的科研动机和目的
动机是推动并维持一个人从事某种活动的心理倾向或心理因素，是促进人们为达到某种
1
目的去从事一种活动的内在原因和直接动力。
对科研动机有影响的因素：
1．性格特点：性格是行为特征的构成因素，同样也是动机模式的决定因素之一。
2．价值观：指人们对客观事物的评估标准与态度体系。
3．抱负水平：使工作能够达到某种质量水平或取得成果的心理因素。
（二）科学研究是探索性活动，需要探索者付出汗水、鲜血乃至生命
（三）科学研究是创造性活动, 研究者要具有首创精神
（四）科学研究是积累性的活动
（五）科学研究对象-----人, 因此，开展研究工作有着更高的要求
（六）科学研究具有社会性
1．:尊重他人的科学劳动成果，正确估计个人的科学贡献，在科研工作中应互相支持、互
相配合，团结协作。强调统一部署和相互配合，彼此互通信息，反对互相封锁信息，反对各
自为政，各行其是。
2．遵守研究工作的规章制度，遵守科研纪律，反对利用协作单位或协作人的科研成果搞
单项研究。
3．仪器及设备和图书资料方面应互相提供方便
4．科研论文及成果应以贡献大小排列名次
5．科研负责人要具有良好的科研素质及品质、广博的知识，不断创新的进取精神、宽容、
及敢于承担风险、尊重他人的劳动的优秀品质，努力创造良好的科研环境的能力。
（七）坚持实事求是
要保证科学研究中诚实原则得到认真的贯彻和体现
1．确定科学研究的课题及进行的实验设计必须有事实依据或科学的理论根据。
2．收集资料应做到实事求是：
（1）科学观察：要求准确而实事求是地记录实验的每一个过程，做到客观地记录阴性和阳
性的全部结果，以避免去记录预想的结果，甚至是捏造的结果。
（2）资料的统计：科学的选择统计方法，统计中要求实。
3．论文撰写：科学求实，不能凭主观想象杜撰论文，甚至假报成果
4．论文发表及申报成果：将前人已做出的结论或已公布的成果与研究者得到的新进展区分
开，不能将他人之功据为已有。
科学技术的发展与道德进步具有一致性，他们互相促进、互相渗透、互相制约
道德与法规有直接关系
二. 科研工作者的素质
（一）德----科研工作者的思想道德和科学道德
德的核心和实质---学会做人
1 热爱祖国,树立爱国主义精神
2 追求真理,崇尚科学
3 既有知识, 又有能力
4 既有学问,又有道德
（二）识-----科研工作者的胆识
指识别能力、判断能力、预见能力
胆识在科研工作中的作用
1．科研意识的强弱取决于胆识的大小;
2．在科研选题中，敢于选择前沿性的有创造性的课题是由胆识决定的;
何谓科学研究的前沿
2
从科学上: 研究的课题要着重深度
从技术上: 项目要着重创新
3. 在观察和实验中根据一定的事实敢于提出假说是需要胆识的.
（三）才----才干、才能和能力
发现才能----敏感性、观察力、动手操作能力；
创新才能----辨别真伪的能力、发现及联想的能力、抽象概括的能力；
要勤于和善于积累知识
（四）学----科研工作者的学习、学问、知识
1．学什麽?
知识经济时代的知识分类:
第一类“明确知识”
• know –what 即关于事实的知识
• Know –why 即关于自然原理和规律的知识(原理知识)
第二类默会知识
• Know –how 即做事情的技艺或能力
• Know –who 即人力知识
2．怎样学
• 精其选----在内容上进行精选
• 解其言---- 在文字上弄懂、弄通
• 知其意-----在理性认识上专研、反复领会其中的意境和真谛，探索书中揭示的奥秘
和规律
• 明其理-----在理解程度上读出自己的新见解，学出自己的新看法，产生自己的新思
想，不作书刊的奴隶
• 善其用-----将理论应用于实践
第三讲医学科研的分类及特点
第一节分类
一基础研究 (Fundamental research )
旨在增加科学技术知识和发现探索领域的任何创造性活动，而不考虑任何特定的实际目的
特点
其成果对广泛的科学领域产生影响，并常常说明一般的和普遍的真理，其成果也常成为
普遍的原则、理论或定律
其研究结果是新观点和新信息，这类研究未知因素多，探索性强，研究周期长，对研究
手段要求高。
内容范围：
(1) 保持人体健康的规律，健康指标的分期基础；
(2) 人体功能与结构的研究；
(3) 疾病发生、发展、转归全过程的规律及分子基础；
(4) 人体衰老过程的规律及分子基础；
(5) 人体的生物力学、流体力学、电子学；
(6) 化学药物的构效关系，植物药的亲缘与有效成分关系
举例
3
(1) 精子膜蛋白的结构及免疫性；
(2) DNA损伤与修复过程中基因结构的变化；
(3) T细胞E受体受刺激后细胞内生化的变化
(4) 经络本质的研究；
二应用研究 ( Applied research )
任何旨在增加科学技术知识的创造性的系统活动，但它考虑某一特定的实际目
特点
具有针对一定的实际应用目的去发展基础研究成果的性质，又是为达到某些特定的和预
先确定的实际目标提供新的方法或途径。其成果对科学技术领域的影响是有限的，针对性更
强。
内容范围：
(1) 有关疾病的病因、流行规律、治疗及预防效果的机制研究；
(2) 为实验研究需建立的新的动物模型、细胞株以及方法学的研究；
(3) 有关流行病学调查、考核防治效果、药物调查的方法学研究；
(4) 寻找新药物、新生物制品、新医用材料的方法、有效药物的药理作用机制、药代动力学、
医用材料的机体相容性的机制研究。
举例：
• 不同抗精子膜蛋白抗体对抗生育作用影响的比较研究；
• 网织红细胞与骨髓瘤细胞杂交系的染色体组型、分带与恶性肿瘤的关系；
• 建立临床检测T细胞功能的技术方法；
• 心律失常的电生理特性及其机制；
• 新光辐射治疗剂的有效成分的生物学活性及其作用原理。
三实验发展 ( Experimental development)也称为开发研究
特点：
是运用基础研究与应用研究及实验的知识，研制出产品性物质，或为了对现有的产品性
物质进行重大改进的创造性活动。
内容
• 有关疾病的新的诊断、治疗、预防方法及措施的研究；
• 有关新药物、新生物制品、新仪器器械、新试剂、新医用材料实验室样品的研制；
• 有关药物的资源调查、植物药的引种试验；
• 心律失常的药物治疗及应用起搏器手术的指征；
举例
• 心律失常的药物治疗及应用起搏器手术的指征；
• 异常血红蛋白病的产前诊断；
• 肢体动脉硬化闭塞病的无创性测定技术的研究；
• 第二代国产肾衰专用必需氨基酸的试制和临床观察；
• 脉冲激光器的研制和改进。
基础研究、应用研究的主要标志：
增加科学、技术知识，以直接产生社会效益为主，
开发研究的标志:
推广应用新技术、新产品，以直接产生经济效益为主。
第二节医学科学发展的几个重大前沿领域
一人类基因组计划（HGP）
4
HGP的主要内容包括：人类基因组的基因图谱构建与序列分析，人类基因的鉴定，基
因组研究技术的建立，人类基因组研究模式，生物信息系统的建立，以及社会，法律与伦理
问题，交叉学科的技术训练，技术转让，研究计划的外延。
二DNA芯片技术( gene chip)
芯片实质是一种寡核苷酸阵列，是采用在位组合合成化学和微电子芯片的光刻技术原
理，将大量特定序列的DNA片断(探针)有序地固化在玻片或硅片上,快速并行地对DNA进
行序列测定和定量分析。
DNA技术的最终目标：将人类的全部基因高度集成到1cm
2的芯片上
三克隆技术
——1997年2月，维尔穆特等利用成年绵羊体细胞克隆成功世界上第一只克隆绵羊“多利”。
——1998年7月23日，用鼠体细胞成功培育出三代共50多只克隆鼠，是人类第一次用克
隆动物克隆出克隆动物
克隆羊“多利” -------克隆牛“能都” 和“加贺”到克隆鼠“卡缪丽娜”，致使人类可利用转基
因技术克隆出携带人类基因的转基因克隆羊和利用胚胎细胞克隆成功的一系列动物。
意义
* 证明了哺乳动物细胞可以复制出新个体，打破了只能使用胚胎细胞克隆动物的传统,
为进一步提供了广阔的前景和新的思路;
* 可以使科学家拥有一项新的有效技术深入研究一系列重要的生物学问题,包括若干疾
病的发病机制;
* 它将成为一项革命性的育种手段;
* 为人类通过遗传操作对动物进行遗传改造提供一个新的途径;
* 标志着现代遗传操作技术在分子、细胞和整体水平上的最新进展
四组织工程
（1）Tissue engieering：在组织水平上操作的生物工程，研究组织和器官的形成和再生
（2）Biomolecular engineering：在分子水平上操作的生物工程,包括基因工程、蛋白质
工程、酶工程、膜工程…..
（3）Cellular engineering：在细胞水平上操作的生物工程，用细胞生物学方法或某些分
子生物学技术来设计或再造变细胞的遗传物质，实质获得新的性状
五阮病毒
是人类继细菌、病毒、真菌和寄生虫后发现的又一类传染性因子。
意义
对于了解人和动物所患的几种与痴呆有关的致命性脑病的发病机制具有重要意义，为药
物的研制与新的治疗方法的建立奠定了基础
六神经科学
七细胞信号传导
八后基因组时代的生物信息学
九蛋白质组等
21世纪将是分子医学及组织医学的世纪
第四讲科研方向、专业目标和科研课题的选择
第一节确定科研方向及专业目标
一科研方向
5
科研工作者在本学科或邻近学科领域内，把那些自己基础理论较好、学术造诣较深、最
有发展前途，也有继续深入研究兴趣的一个学科或两个及两个以上学科的交叉处、空白区
确定为自己今后长期为之奋斗的主攻方向，这些学科或交叉处就是确定的科研方向
二确定科研方向及专业目标的原则
1. 根据个人兴趣来确定
* 兴趣是科研工作者在事业上成败的关键
* 是科研事业上的行为动力
2. 根据社会需要和科学发展趋势来确定
3. 根据个人的才能和其他人的意见来确定
WHY TO DO THIS
（1）从战略上看
* 科研方向和专业目标决定了科研选题的方向与范围
* 科研方向和专业目标是培养与造就专家与学者的有效途径
（2）从战术上看
确定科研方向和专业目标对科研方法的选择有直接的影响
三确定科研方向和专业目标时应注意的问题
1．进行反馈调节
科学、准确和可靠的科研方向和目标需经过论证、实际检验、反馈调节确定下来
2．防止从众心理，切忌赶时髦。
3．防止旁驰博鹜，切忌朝三暮四
4．要防止厌战情绪，切忌急于求成
第二节科研选题的步骤及原则
一. 要求：完整、严谨、具有明确目的性、先进性与科学性
——海森堡：“提出正确的问题，往往等于解决了问题的大半”。
——爱因斯坦：“提出一个问题比解决一个问题更重要，因为解决一个问题也许是一个数学
上或实验的技能而已，而提出新的问题。却需要有创造性的想象力，而且标志着科学的进步”。
如何选题是对研究者各方面能力的的检验，包括：科学思维能力；理论认识能力；掌
握前沿进展的能力；实验能力以及检验研究是否能达到预期结果
常出现的问题：缺乏构思成熟的科学理论，或目标不正确
二. 选择科研课题的基本原则
第一需要性原则
1. 考虑课题的价值----科学价值、实用价值、经济价值
2. 近期需要与长远需要的的关系
3. 正确处理基础理论和应用技术研究的关系
第二创造性原则
1. 选择应用技术研究课题，要考虑课题能否成为新发明或技术革新根据的可能性
2. 对于基础理论研究课题要考虑所选课题能否导致重大发现和理论创新的可能性。
3. 以新的观点、新的角度、新的水平、新的方法等选择一些继承发展、革新,创造性的研究
课题
做到：人无我有，人有我多，人多我新
第三科学性原则
6
基础理论研究及应用技术研究的课题的选择和确立，都必须有一定的事实根据或科学理论
根据。
第四可行性原则：注意①主观条件；②客观条件；③个人条件；
1. 正确评价研究者的知识结构和水平，以及研究能力、思维能力及个人的兴趣
2. 正确评价客观条件是否具备
3. 发挥主观能动性，积极创造条件
第五专一性原则
1．专一性即意谓着科研课题不宜太大，要选择其未发现、未涉猎的领域；
2．在深入专一性研究中，可发现一些新现象、、新问题，而成为进一步研究或选题的新起点，
这就是题目的再扩大或科研的再深入；
3．开展深入的专一研究，有利于新的突破和培育独特的专长，使自己始终站在领先的高度，
甚至形成学派权威或学术思想体系。
第六效益性原则
——社会效益
——经济效益
——科技本身的效益
——生态效益
选题常出现的问题：
贪大求洋，题目选得过大；
手段方法定的过高，甚至脱离现实和客观条件；
三. 选题的来源
（一）理论研究课题的基本来源
1. 从社会生产和现实生活需要中提出来
2. 从科学实践与原有科学理论的矛盾中提出来
3. 从学科交叉所产生的空白区中提出来
4. 从对已有的理论、传统观点和结论的怀疑中提出来
5. 从新领域的经验事实中提出来
6. 从学术问题争论中提出来
7. 从理论内部的逻辑矛盾中引出来
（二）. 应用课题来源
1 从社会生产的需要中提取出来
2 从社会现实生活需要中提出来
3 从科学实验中提出来
4 从国家、企业或科学共同体来的研究课题
四选题和立项时应注意的问题
1. 结合自身优势，选择好研究领域或研究方向
2. 拓宽思路，既熟悉本领域的研究进展，又熟悉相关领域的研究进展
3. 加强合作，利用他人的优势充实和发展自己
4. 善于运用科学的思维方法，是提出新问题、产生思想火花、跳出旧框框的最佳途径
5. 选题的研究目标要具体
举例
《高血压相关基因研究》：评价：题目大，可行性差
《我国蒙古族人群胰岛素受体基因多态性与高血压关系的研究》评价较好
7
6. 选题要与工作基础、技术条件及经费相结合
7. 要做到知己知彼
五选题的条件及评价标准
1. 选题的条件
（1）有重要的科学意义或重要的应用前景
（2）学术思想新颖，理论依据充分，研究目标明确、具体，研究方法和技术路线合理可行，
渴望获得新的科学发现，或近期可取得重要进展
（3）立项者和项目组成员具有实施项目的能力可可靠的时间保证，并具有基本的研究条件
2. 选题的评价标准
（1）项目的理论依据
* 研究意义：有重要的科学意义或属国民经济建设中的重要科技问题
* 学术思想：有明显的创新性
* 充分的立论依据
* 了解国内外研究现状
（2）研究方案和研究目的
* 研究内容和拟解决的关键问题：紧紧围绕研究目标，重点要突出
* 研究方法：可行且有创新
* 技术路线：合理可行，且有创新
* 研究的预期目标
（3）研究基础
* 与本项目有关的研究工作积累：是原有工作的进一步深入
* 已具备的实验条件
* 项目组成员：结构合理、研究力量强
（4）综合评议
* 以往完成项目情况，项目的创新性
六选题前的准备工作
（一）占有充分资料
第一初步选定一个研究方向或题目
第二整理资料,理出资料之间的关系
第一手资料原文
第二手资料综述
第三手资料教科书及现场调查
1. 如何应用文献资料
文献是知识的宝库，汇集和保存了人类创造的精神财富.它在实践上的传递，实现了
时代与人之间的文化集成和发展，它在实践上的传播，促进了当代人的信息、技术交流与共
享,加速了社会的进步。
文献记载着研究成果，从事研究的人和时间，使后人了解某一研究的起源,发展,在借
鉴的基础上发展，创新.加速科研工作的进程。
2. 文献检索的作用
（1）“桥梁”作用：文献检索是连接文献生产者与文献需求之间的桥梁，也是当代人继承前
人的知识进行创新的桥梁
（2）“钥匙”作用：文献信息是知识的宝库,检索工具就是启动科学研究工作的钥匙。
（3）节约作用
（4）导向作用
8
3. 文献与情报资料的搜集
第一文献与资料种类与来源
书籍-----教科书、论著、专著
报纸----快、新
期刊-----发行周期短、内容新颖、论述深入、发行数量达、影响面广、反应当前最
高研究水平
专利文献---含有极为丰富的技术研究用的资料
科技报告和政府出版物---涉及尖端科技的最新课题
正在进行的科研项目情报
学位论文---有一定的独创性见解
学术会议文献
技术标准----内容详实、完整，能直接应用，富有指导性
产品样本----一般技术可靠、数据齐全
第二文献与情报资料的搜集原则
（1）逆时法原则-----节约时间，能搜集到更新、更全面、更可靠的资料
（2）有限制原则
‹ 对搜集资料的时间安排做出限制
‹ 对资料的数量做出限制
（3）准确、可靠性原则
4. 如何阅读
(1) 阅读题目：选择切合需要的文献（快速从大量的文献中选择
(2) 阅读摘要：选择切合的题目后，可以阅读提要或摘要，借以了解全文内容；
(3) 阅读序言：可以了解要解决的问题
(4) 阅读结论：可以概括全貌
（5）阅读统计结果，分析和讨论
5. 阅读方法
(1) 浏览：是阅读最常用和最基本的方法:节约时间,受益匪浅,对于取舍选择文献是一种有
效的方法.
（2）粗读
（3）精读：是对文献内容的深入认识，同时也是酝酿科学的抽象过程（做题录或摘要）
* 读序言：从这部分可了解作者所做研究的概况，或想要解决的问题。
* 读结论：了解作者所做出的研究工作结果的概括和归纳，从而根据自己掌握的
信息，对其取舍。
* 读中标题：了解作者的学术思路
* 读图表：只了解一个概况
（二）提出初始问题，建立假说
假说是对科学上某一领域提出新问题，并对这个问题提出未证实或未完全证实的答案和
解释。
1．科学假说的提出与建立
（1）科学假说的显著特点：
¾ 假说是以观察实验搜集的事实材料为基础，以科学知识为依据，所以它具有科学性
¾ 假说是对事物存在的原因及规律所做的某种推测性的说明和解释，决定了任何假说都必
然带有猜测的性质。
（2）科学假说的形成与建立应具备的条件
9
¾ 要具有标新立异的特点
¾ 重视科学探索中的机遇
¾ 要有综合性，扩大知识面
¾ 及时提出新的假说
¾ 假说的内容或推出的结论不应包含逻辑矛盾
¾ 具有科学原理
2．假说的作用及地位
（1）假说的作用
假说使人们为达到某种结果而有计划地进行各种观察和实验，是科学研究中的重要步骤
和基本程序；
假说是从观察的事实出发，通过概念、判断、推理对所探索的问题提出初步的、推断性
的带有假定意义的理论解释
假说是发现、认识事物内部规律、建立新的科学理论必须经历的一个重要阶段和不可缺
乏的形式与方法；
假说是任何科学理论的初始阶段；
假说是人们认识达于科学理论的桥梁；
假说是未经实践证明的理论；
假说是人们从个人或前人的实践经验、科学积累中通过分析和综合，对所选课题可能得
到的预期结果的解释
假说是来源于实践中得到的事实或理论；
假说是对被研究问题的规律性认识的推测
（2）假说的地位
观察和实验是科学发展的基础，假说是科学发展的形式
“只要自然科学在思维着，它的发展形式就是假说”
——恩格斯
假说是科学研究的主线
观察和实验是科学躯体，假说和理论是科学的灵魂，贯穿于整个科研过程中。科学研
究的全过程就是提出假说和验证假说的过程，所有的工作程序紧紧围绕着这条主线有次序
地、有要求地严格进行安排。
科研过程可分为3个阶段10个步骤
第一阶段：选题过程
1）original idea or problem
2）critical review of literatures
3）formulation of hypothesis
4）statement of the problem
此阶段主要问题在于提出假说和选择验证手段，并对两者进行全面系统地说明，是选题
者和审题者更清楚地判定选题的合理性、科学性，即假说验证的合理性。
第二阶段：安排实验
5）experimental design
6）experimental investigation
7）accumulation of raw data
此阶段是围绕验证假说安排实验内容和从事试验工作，搜取论证假说的根据，累计资料
和数据
10
第三阶段：整理资料，完成论文
8）treatment of raw data
9）statistical analysis
10）conclusions
此阶段是整理验证假说所需要的数据，通过分析、综合、归纳、演绎等逻辑过程，使假
说（论点）和资料（论据）有机地按照逻辑规律结合起来，完成具体论证过程，假说成为结
论。
第五讲医学研究的方法学
核心内容----- Design
Measurement
Evaluation （DME）
一设计（Design）
1. 目的用较少的人力、物力和时间，获得较为可靠的结果，使误差减少到最低限度，并
对结果的误差大小做出准确的估计，以达到研究高效的目的。
2．医学科研设计的内容
(1) 科研目的和理论假说的确立
(2) 确立研究设计方案
(3) 研究对象的选择
(4) 估算合适的样本量
(5) 安全和正确的措施
(6) 确定研究的观察指标和观察期限
(7) 确定正确的资料分析方法
(8) 严格的质量保证措施
二测量（Measurement）
研究者使用科学的方法和技术来发现和度量发生在环境中和动物或人体中的某些效应。
1. 医学研究中常用的测量指标
(1) 疾病发生的频数(发病率、患病率等)。
(2) 疾病的后果（死亡率、病死率、并发症的发生率等）
(3) 疾病的症状和体征
(4) 疾病对身体和精神的影响
(5) 疾病预后的估计
(6) 各种实验室数据的测量
(7) 卫生经济学的指标测量(疾病的预防、治疗成本等)
2. 评价测量质量的标准：
(1) 真实性：测量结果与所测量的事物真实情况的符合程度；
(2) 可靠性：重复测量结果的一致性
a) 实验的措施要具有反应性和可度量性；
b) 测量方法要具有良好的敏感性和特异性
11
c) 测量指标的判断标准和临床意义要明确
三评价（Evaluation）
实验的意义及临床意义的评价
1. 研究结果的统计分析和评价
2. 研究结果的经济学评价
3. 卫生项目的综合评价
第一节设计与观察
一实验设计
1. 实验设计的一般要求：科学性，严密性，合理性，高效性。
2 实验设计的原则
随机原则：-将随机抽样的样本应用随机分组的方法将研究对象分配到试验组或对
照组中, 接受相应的处理。常用的随机抽样方法如下：
简单随机抽样：抛硬币、抽签查随机数字表及计算器随机法等
分层随机法：根据研究对象的特点为分层因素，按照分层因素分层后再进行随机分组
系统随机抽样：将所有研究对象按照设计要求的抽样单位依次编号，先随机抽取第一
个观察单位，再依次按照一定的间隔抽取其余的观察单位。
多级抽样
半随机法：将研究对象奇数和偶数进行分组。
盲法原则：公开、单盲、双盲、三盲（研究者、研究对象、资料分析或报告员）
重复的原则：重复是指处理组与对照组的受试者要有一定的数量，也就是样本含量
大小问题。“重复”最主要的作用是估计试验误差。实验误差客观存在，只有重复测量
试验效应的指标，才能通过观测值的差异计算出试验误差大小。设置重复的另一作用是
降低试验误差，从而提高精密度。
对照原则：设立条件相同、诊断方法一致的一组对象，接受某种与试验组不同的实
验措施，目的是与试验组的结果进行比较，以证明两组或多组间结果的差异及程度。对
照的意义在于鉴别处理因素与非处理因素的差异，消除和减少实验误差
（1）同期随机对照：研究对象同时间、同地点选择，以随机分配方式分组；可比性
强，避免了选择性偏倚，结果更具说服力
（2）自身对照：对照与实验在同一受试对象进行。
（3）历史性对照：将新的干预性措施的结果与过去的研究比较，是将研究者以往的
研究结果或他人的研究结果与本次研究结果作对照。
（4）非随机同期对照：研究对象是同时间、同地点，用非随机分配的方法分为试验
组和对照组，分组的方法不是随机的；
（5）配对对照：将试验组对象按照配对因素与对照组相配对
（6）空白对照：对照组不加任何处理因素
（7）实验对照：采用的与实验组条件一致的对照措施
齐同原则：除处理因素外，不同比较组研究对象的其它因素或条件相同，即组间有
较好的可比性。齐同是进行比较的前提,没有齐同就没有分析比较的价值。
齐同性
* 比较组间除接受的处理因素不同外，其它条件应相同，保证组间的均衡性。
* 对实验效应的观察方式要相同,包括采用相同的仪器设备、测试手段、观察方法等。
3 专业设计
12
* 确定所采取的处理因素；
* 确定研究对象；
* 确定观察指标
（1）指标的客观性与重现性；
（2）指标的合理性，灵敏性；
（3）选择指标的数目；
（4）选定的实验方法、仪器设备及环境等。
4 统计设计
* 确定研究对象的数量；
* 设立对照组、随机化分组；
* 制定原始纪录表；
5 结果的预测
6．组织设计
* 进程的安排；
* 实验组人员确定和培训；
* 经费的预算。
科学实施
二实验与观察
1. 实验是积极干预被研究的过程，以暴露现象中的特性，即人们根据研究的目的，利用科
学仪器，人为地控制或模拟自然现象，排除干扰，突出主要因素，在有利的条件下研究与观
察事物的内容联系。
2 观察：观察是对自然或社会所发生的现象和过程进行有计划，有目的考察的一种研究方
法。
3 实验与观察中的机遇问题
机遇可分为两种1）部分意外的情况，即所要寻找的目标是明确的，但发现的场合和方法
却是非常意外的；
2）完全意外的情况，即本来要追求的是某种预期的现象，结果却意外的
发现了完全不同的另一种重要的现象。
机遇对每一个人的效果是不同的，问题的关键是能否抓住它、认识它，并能充分利用它。
三学科交叉意识
各学科之间的相互渗透已经成为现代科学发展的一个特点。各学科的边缘区是研究不充分
之地；而各门学科之间的交叉点，往往是空白点。但科学的“无人区”并非禁区，而是带开
垦的科学处女地。这是在科研选题中应注意的。
第二节医学科学研究思维方式
（一）创造性思维的特点
1. 独立性
2. 连续性
3 . 多向性
4. 跨越性
5. 综合性
（二）直觉——模型
直觉：指透过事物的感知一瞬间做出的确定与评论的飞跃性思维。
模型：指直觉思维所形成的构成或直觉目的，同时又对直觉中的错误进行纠偏。
（三）归纳——演绎
13
归纳：指从大量的实验结果中构造出新的模型，新的知识，从而归纳出新的原理。
演绎：指从某些概念，公理或法则出发，运用逻辑推理得出新结论的思维方式。
杨振宁“我很幸运，归纳和演绎这两种思维方式，使我受到了很好的训练”
（四）想象——验证
想象是人脑对已有表象进行加工改造而形成新形象的过程。想象具有假设、猜测、幻
想的品格，它是形象思维的高级阶段，超越与经验事实，极富有创造性。
（五）相似思维
一切事物之间均存在着有条件（相对）的相似性。人们经常利用事物之间的相似性进
行创新。因此相似思维是一种重要的创新思维。
1 . 事物间相似性的表现形式
（1）哲理相似或方法相似
（2）关系相似
（3）机制相似或行为相似
（4）性质相似
（5）功能相似
（6）组织结构相似
2. 事物相似的相对性
（1）层次性
（2）局部性
（3）条件性
（4）目的性
3 应用事物相似性的基本模式
（1）归纳法
* 形成新的学科或学说
* 预见未知事物
* 将事物按某种相似性分类
（2）模仿法
（3）类比法
（六）求异思维
又称为逆反思维或求逆意识。求异思维的特点在于：求疑；抗压；自变；标新
求异思维常用的构思方式如下：
1. 反向构思
2. 侧向构思
3 . 缺点逆用构思
（七）系统思维
研究事物（特别是复杂事物）的要素构成及其相关制约关系。其基本观点在于：
1. 以技术融合为基本手段
2. 着眼于总体目标
3. 以协调匹配为关键
4. 以系统目标及其各要素的关联为前提。创新力量不仅要有科学知识，而科学知识加科学
思想再加科学方法才等于创新力量。一切科研创新活动，不仅需要知识和经验，更需要创新
意识和创新思维。可以说，创新思维是创新活动的基石，更是医学科学研究的灵魂。
14
第三节实验的基本要素及误差控制
一实验的类型
㈠预备实验
1导向性实验：小规模实验，目的是对假说进行初步的检验
2 观测性实验：目的是搜集实验所需数据，如均数、变异程度、组间差异程度等数据
3 筛选性实验：用大量观察对象进行的初步简单实验
㈡决定性实验
是总括性、关键性试验，用以检验假说的正确性
㈢正式实验
必须有明确的目的和良好的设计
二实验设计
1 确定研究目标；
2 根据研究目的确定研究对象；
3 根据研究目的提出研究的内容及技术路线
4 确定研究对象的数量（样本大小）
样本量的大小直接影响研究结果的可靠性
样本量太小的不到预期结果
样本量太大,耗费人力、物力、财力、时间，甚至不能完成项目
5 选择适合的研究方法及统计学方法：运用统计学知识和方法进行设计。主要体现研
究的可重复性、高效性和准确性；减少或排除误差，保证样本的代表性、样本间的可比性，
实验结果的准确性，使研究工作通过最小量的消耗，取得最大量的信息，是科研工作可靠
性及高效性的有利保证
6 制定出完整的原始记录方案
7 研究组织工作和经费预算
8 注意误差与偏倚的控制
误差是指研究观察结果与真实情况之间的差异,即样本统计量与相应参数之间的差异.
㈠误差的产生与控制
误差产生原因：
1. 抽样误差：又称随机误差，是由个体差异所造成。
解决方式（1）增加样本量
（2）严格按要求进行试验设计
2. 过失误差：是研究操作过程中研究者的偶然错误所造成。
3. 系统误差：研究中由于所用仪器不准或试剂不精而造成。
（二）偏倚的产生与控制
偏倚指在研究或推论过程中所获得的结果系统地偏离真实值。是在研究设计阶段，实施
阶段，由于某种或某些因素的影响，使得研究或推论的结果与真实情况存在系统差异，产生
原因包括：
1. 选择偏倚
由于选择研究对象的方法存在问题或缺点而使研究结果偏离真实的情况。例如样本不能
代表总体；研究入选者与未入选者的某些特征有系统差别；比较组间条件不齐同等。
2. 信息偏倚(观察偏倚)
系指在收集资料过程中，由于各比较组之间测量方法或指标观察的方法不可比而导致研究
15
结果与真实情况的差异。产生的原因主要有
研究者主观认识原因
被研究者心理因素的影响
不同时间、地点、场合、不同的人员开展的研究工作可能会产生一些误差，在做临床研究
工作中，研究者对被研究者进行暗示
三实验设计三要素
（一）受试对象：指被实验的客体，要符合试验目的。
1.基本条件
⑴敏感性：即受试对象对被施加的处理因素应有较高的敏感性，容易显示效应。
⑵特异性：即受试对象对被施加的处理因素应有较强的特异性，排除非处理因素干扰
⑶稳定性：即受试对象对被施加的处理因素的反应有较大的稳定性，减少误差。
⑷经济性：指受试对象容易找到，费用低。
2.特殊条件
⑴ 动物：必须为纯种、健康等
* 实验动物的种类: 大白鼠、小白鼠、兔、豚鼠、狗、蛙、猴、牛、羊等
* 实验动物的品系
* 实验动物的个体条件
⑵ 人体：患者必须为无合并症（同质性）
① 一般条件：种族、居住地区的外环境、性别、年龄、嗜好、生活习惯等。
② 社会因素：职业、居住条件、家庭情况、心理状况等。
③ 疾病因素：病种、病型、病期、病程、病情、诊断方法、诊断标准等。
⑶ 生物材料
离体器官、组织、细胞、部位、采集条件、新鲜程度、保存方法及培养条件等。
（二）处理因素
外加于受试对象上在实验中需要观察并阐明其处理效应的因素。包括物理因素、化学因
素及生物因素。
（1）处理因素的数目与水平。处理因素可为单因素或多因素
（2）处理因素的标准化
（3）搜索非处理因素，并加以控制
Attention
①抓住主要矛盾：选择能反映“假说”的主要处理因素和恰当的水平。
② 注意处理因素间的相互作用
③注意因素的强度
④注意区别处理因素和非处理因素
⑤处理因素要标准化
Attention
①要明确采用的具体检测方法、原理及特点，操作规程。
②仪器的名称、产地、型号、规格、性能、精密度都应明确，并制定标准，使用及维修常
规。
③根据课题的性质和目的、要求，明确观察的时间。
（三）实验效应：是处理因素作用于受试对象的反应，是研究结果的最终体现，也是实验研
究的核心内容，它通过实验指标来表达，如果指标选择不当，为能准确地反映出利因素的作
用，获得的研究结果就缺乏科学性。选择好实验指标是关系研究成败的重要环节。选择指标
的依据如下
16
1.关联性
所选指标应与研究目的有着本质的密切的联系，能够确切地反映处理因素的效应，可通过
查阅文献资料或理论推导来确定指标的有效性，也可通过预备实验或用标准阳性对照来验证
其有效性。
2客观性
是借助检查、检验方法等手段所观测记录的指标及检验数据等。
3灵敏性
所选指标对处理因素所产生的效应具有敏感性。应选择敏感程度高的指标，以使实验效应
能够充分地显示出来。
4精确性
指标的准确度和精密度。准确度是指观察结果的真实程度；精密度是指观察结果的广度与
深度。
5稳定性
指标的变异程度。在设计时要注意选择稳定性好的指标。
6 特异性
指标的排它性。特异性高的指标，易于揭示出事物的本质特点而不易受其他因素的干扰。
在实验设计时，应注意选择特异性强的指标。
第六讲医学论文撰写
医学论文是以医学科学及与之有关的现代科学知识为理论指导,经过科研设计,实验与临
床观察或现场调查后,将所得的第一性的感性资料经过归纳分析,统计处理等一系列的思维活
动后写成的具有一定先进性的文章;或者在第一性资料的基础上,运用第二性资料综合而成的
文章。
医学论文是科技论文组成部分，因其种类不同，在写作的目的、内容及表达形式上也各
有不同，虽互有差别，但它们的要求却是共同的。作者在撰写时必须坚持严肃的态度、严谨
的学风、严密的方法，遵循其基本原则进行。
第一节医学论文撰写的基本原则
一、创新性
“创”是创造、创见，指论文报道的主要内容是前人未发表过的，其研究成果是他人没有做
过的新发现、新理论、新方法、新工艺等。
所谓“新”是指论文提供的信息是鲜为人知的、新颖的、非公知公用的，即使是在他人研究的
基础上，也应仿中有创，仿中有新，有所发现，有所改进，推陈出新，有新意，有自己的独
到之处，不能步人后尘，低水平地重复。
二、科学性
是医学论文的核心，是衡量医学论文水平的重要条件，是首要条件
1、真实性，就是尊重客观事实。取材确凿可靠，实验设计合理，方法先进正确，研究结果
忠实于事实和原始资料，讨论的论点、论据真实、有据。
2、准确性，论文要客观、准确地反映研究结果的真实情况。
3、逻辑性，就是用科学的逻辑思维方式将经过实验或临床观察收集到的感性材料经过分析、
综合、概括和推理，来论证和阐明现象的本质。
4、重复性，亦称为再现性。如果他人采用同样的实验方法不能重复得出所报道的研究成
果，则该论文既无科学性，也无实践性，没有任何应用价值。
17
三、实用性即实践性：指论文的实用价值，是论文的基础。
四、可读性：论文发表是为了传播交流或为了储存新的医学科技信息，以便为读者或后人
所利用。
五、规范性
（一）前导部分：题目（title ）; 作者署名和地址; 摘要(summary ); 关键词(key words) 。
（二）主题部分：前言（introduction ）；材料与方法 (materials and methods ) ；结果 ( results );
讨论(discussion ) ；结论(conclusion ) ；致谢(thanks ) ；参考文献(references )。
（三）附属部分图(chart ) ；表(table ) ；照片(photoshop) 。
第二节医学论文的分类
一般按论文资料来源、写作目的、医学学科及课题性质、研究内容及资料内容、论述体裁
等进行分类。
一、按论文资料来源分类
（一）原著：是根据具体选题所进行的调查研究、实验研究、临床研究及临床工作经验的
总结。
（二）编著：其内容主要来自己发表的资料，即以间接资料为主，属于第三次文献。
二、按论文写作目的分类
（一）学术论文
是对医学科学领域中的问题进行总结、研究、探讨，表述医学科学研究的成果，理论性的
突破，科学实验或技术开发中取得新成就的文字总结，作为信息进行交流。
（二）学位论文
是学位申请者为申请学位而提出的供评审其科研水平的学术论文，是考核申请者能否被授予
学位的重要依据和必备条件。
三、按医学学科及课题的性质分类
（一）基础医学论文：包括实验研究和现场调查等，少数属于技术交流范围，即介绍实验
技术，有关仪器的设计、制造及使用等。
（二）临床医学论文：多为应用研究，可分为诊断、治疗、护理等方面，有理论研究和技
术报告。
（三）预防医学论文：多为应用研究范畴，可分为卫生保健、防疫、流行病学调查等。
（四）康复医学论文（恢复健康所应有的功能称为康复医学）。它包括了基础医学、临床医
学的内容，还有各种恢复功能的疗法。
四、按论文的研究内容及资料内容分类
（一）实验研究
（二）调查研究
（三）实验观察
（四）资料分析
（五）经验体会
五、按论文的论述体裁分为：论著、经验交流、技术方法与技术革新、文献综术等。
第三节医学论文写作步骤与方法
一、写作素材的获取
㈠认真选题
18
㈡重视查新
查新的目的和意义：决定选题，了解历史、现状、动向，解决实际问题，衡量论文的价值。
确立查新的时限、范围。
㈢严密设计
㈣合理组材
二、写作前的准备
（一）原始资料的处理
1、原始资料的整理：注意保存那些能够阐明、证实研究设计提出的假说或观点的部分（系
统化、条理化）。
（1）数据的检查：
方法：①逻辑检查法；②计算检查法。
（2）数据的分组
分组法：
* 质量分组：按研究对象的特征的类别（性质）进行分组（性别、职业、疾病分类等）；
* 数量分组：按研究对象的特征的数量大小进行分组（年龄大小、血压高低）。
* 等级分组：将研究对象按某种属性的不同程度分组。如用某药治疗若干痢疾病人，按治
愈、好转、无效进行分组。
分组时应注意的问题
* 分组只能在同质的基础上进行。
* 进行数量分组时，当尚不了解被研究对象的变化规律时，宁可先分细一些。
* 分组时应尽量注意科研的习惯性。
* 数量分组的界限要清楚。
2、原始资料的组织
⑴材料的取舍
* 实验结果获得了预期效果，能够说明原来的假说，为获取资料。
* 实验结果基本上完成了假说中的项目和指标，但不够完整、充分；
* 实验结果基本上不能完成原来的假说，甚至出现了预料不到的现象。
问题
* 设计是否考虑周全；
* 实验方法是否妥当
* 数据资料是否可靠
* 补充试验解决
* 修正结论
⑵注意对材料的深化及材料的表达方法
⑶材料的层次
以围绕论文的主题，有层次地安排在论文的各部分，使各部分内容之间保持内在的联
系，由浅入深，由非特异性到特异性，以揭示事物的客观规律。
例如：
文：《电动工具工人手部骨与关节改等的动态观察》作者按以下四个层次加以组织。
假说：受振局部发生神经血管损伤
第一层：自觉症状；
第二层：受振工人的各种感觉；
第三层：手部冷水试验；
第四层：受振工人手外刑和骨质；
19
（二）拟订提纲
（三）拟定论文题目：命题时应考虑以下几点：
（1）题目应反映研究成果的深度和广度：
论文题目《铅中毒的实验初步观察》
《铅中毒与肾功能的探讨》
修正后：《铅中毒对大白鼠肾小管滤过功能的影响》
（2）题目应当体现提出的假说
如：《空腹急性滑动平滑运动对糖尿病患者代谢的影响》
假说：空腹运动对不同类型糖尿病患者代谢有不同的影响。
（3）实验性研究时，应将实验的三个基本要素（处理因素、实验对象、实验效应）都包含
在论文的题目中。例如《铅对大白鼠肝肾组织病理学的影响》。
（4）题目应当用限定词指示出研究的性质（研究、实验、调查、报告、分析、讨论、作用、
影响、关系等）。
（5）题目的文字最好在20个汉字以内，并与英文题目应当一致。
例：《3种产生乙型肝炎病毒的裸鼠移植瘤模型比较》。
《“Study on nude mice loading transplanted tumor producing HBV”》
修正后《Comparison of three models of nude mice loading transplanted tumor producing HBV》。
（四）论文构思：
1、考虑三方面：
（1）文章从何处说起才能够最切题和最有吸引力；
（2）阐述、推理或反驳等论证的实质性问题如何穿插展开才能全面、准确、简明地说明问
题和最具有说明力；
（3）文章在何处、以何种方式的语言表达最为适宜。
2、拟定提纲：提纲是论文的骨架。
提纲分标题式和提要式二种。标题式题纲用名词或短语标出每一段的内容要点；提要式提纲
则把标题或提纲中每一内容的要点展开，对论文全部内容作粗线条的描述。。
拟定提纲时注意的问题
（1）论文以何种形式发表，准备投送何种期刊，该刊的发行范围，读者对象是什么。
（2）明确主题，包括问题的提出和课题的意义，避免让人读后抓不住重点。
（3）在他人研究成果的基础上，或应用他人的实验结果时，处理好二者的关系，不要使读
者产生相互混淆甚至互换的错误。
（4）数据推导的结果或结论必须正确，在理论分析过程时，不应出现前后矛盾或牵强附会
之处。
（5）明确结论（或结果）的应用范围和前题，正确自处理好它们之间的相互关系。
（6）论文的内容，格式及表现手法应充分表达写作目的，围绕主题展开。
（7）要注意论文发表的礼节。
第四节医学论文撰写格式
一、医学论文的书写格式，分三个主要部分：
（1）前置部分：文题、作者单位、署名、内容摘要、关键题
（2）主体部分：前言、材料与方法、结果、讨论、结论、致谢、参考文献、外文摘要
（3）附录部分：图表、照片、作者附言等
撰写要术：
20
（1）熟悉与写作主题有关的理论和基本概念；
（2）论点鲜明，论据充分，论证有力。
（3）说理为主，举例说明的内容仅是旁证的衬托，应点到为止，不可长篇大论。
（4）逻辑严密，层次分明。
二、论著撰写的基本格式
㈠文题：一般包含研究对象，论文所解决的问题及其贡献所在。
①确切，即准确而贴切。
②简洁，文题要言简意赅地概括全文，突出主题,具备检索性。
③醒目。
要求：（1）新颖醒目（2）具体确切（3）简短精炼（4）准确而得体
例：《低密度脂蛋白受体活性检测新方法》
注意：
（1）不用非公知公用的缩略词，缩写字、符号、代号、公式等；
（2）避免用疑问句、主谓宾结构的完全句，以及宣传鼓动方式的状语；
（3）忌冗长、繁杂、笼统、夸张、不切题或含义不清；
（4）外文题名，不超过10个实词；
（5）一般不加标点符号。
副题：用于补充，完善论文中的特定内容。
（1）题名语意未尽
（2）研究报告、论文分册（题）出版
（3）其它，如引伸说明等
㈡作者及单位署名
要求：（1）是论文课题的创意者，设计者和实施者，是论文的执笔者，并能对关键性的学
术问题作解释和答辩。
（2）按贡献大小，工作主次，多寡依次排名。
（3）署真名、全名，不署笔名。
（4）学术论文署名应实际求是地论功署名。
（5）切忌争署名，争名次。
注意：署名不宜过多。
㈢内容摘要(abstract ) 是对论文内容的高度概括，是不加注释或评论的简短陈述，起到画
龙点睛的作用）。
1、要求：
（1）精炼确切地反映原稿的精华、要点，突出创新和主要发现。
（2）有数据有结论，是一篇完整的短文，可独立使用，可引用推广。
（3）撰写应规范，内容包括：
※ 研究目的
※ 基本方法和步骤
※ 主要结果和重要发现
※ 主要结论
※ 主要经验教训和应用价值
（4）简明扼要，高度概括全文主要内容。
（5）用电报体裁书写（即第三人称），不分段、每个字、每段话多都提供信息。“对….
进行了研究” 、“报告了….现状”
（6）其它：缩略语、略称、代号在首次出现处必须加以说明；论著、经验交流、综述
21
等长篇文稿应写摘要；病例报告、短篇报道等不写摘要。
（对论文内容的高度概括，是不加注释或评论的简短陈述，起到画龙点睛的作用）。
2、一般原则：基础医学、临床医学、论著和重要论文，字数在3000字以上，要有摘要。以
第三人称形式写作。
3、摘要字数：200字左右。
4、基本内容：
⑴研究的目的；
⑵基本步骤（包括研究对象，实验动物，观察及分析方法）；
⑶主要发现（包括重要数据及统计学意义）；
⑷主要结论。
文《慢性肾盂肾炎与叵细胞病毒感染关系》
摘要：目的探讨叵细胞病毒（CMV）感染与慢性肾盂肾炎发病的关系。方法应用免
疫斑点法检测慢性肾盂肾炎患者尿液中CMV，酶免疫吸附试验抗测患者血清中CMV抗体。
结果68例慢性盂肾炎患者中36例尿液CMV抗原检测阳性（53%）；39例血清CMV抗体
阳性（57%）；50名健康对照尿液CMV抗原阳性4例（8%），血清CMV抗体阳性7例（14%），
=组相比较，差异有非常显著意义（P＜0.01）。结论提示CMV感染可能是肾盂肾炎病因
中的一个重要因素。
5、英文摘要
⑴包含的内容：目的、方法、结果和结论四部分。
⑵中、英文摘要的一致性
⑶选择适当的时态和语态
①时态：ƒ叙述研究过程，多采用一般过去时；
ƒ采用一般过去时叙述研究过程中提及在此过程之前发生的事，宜采用过去完成
时；
ƒ说明某课题现已取得的成果，宜采用现在完成时；④摘要开头表示本文所“报告”
或“描述”的内容，以及摘要结尾表示作者所“认为”的观点、“建议”的做法时，可
采用一般现在时。
②语态：多数情况下可采用被动语态。
《The authors developed a new diagnostic nethod for syphilis.》
《A new diagnostic method for syphilis was developed.》
《The experts consider the drug has an excellent therapeutic effect for tonsilitis.》
《The drug is considered to have an excellent therapeutic effect for tonsilitis by the experts.》
（四）掌握一定的遣词造句技巧
1、用词：简单，尽量用短词代替长词，如study代替research, investigation。
方法的描述以及步骤的描述以“用狭义词代替广义词。”
2、造句：常用句型
①表示研究的目的，常用在摘要之首；
In order to……
This paper describes……
The purpose of this study is……
②表示研究的对象与方法
curative effect drug observed
The sensitivity of Kit was detected
function certain organ studied
22
…… …… ……
(by certain method or under certain conditions)
③表示研究结果
The result showed
It proved that……
The authors found
3、尽量采用—ing分词和—ed分词作定语，少用关系代词which，who等引导的定语从句。
《A cell strain which could secrete McBbs was esablished.》
《A cell strain secreting Mc Abs was estabilished.》
《The titer of the virus which had been cultured in Vero cells for 24 hours was detected.》
《The titer of the virus cultured in Vero cells for 24 hours was detected.》
①关键词
用以表示全文主题内容信息，是论文的信息点和检索点，一般为2--5个
ƒ从文稿内容中提炼出最能反映文稿的主要内容的名词、词组或短语，并最能说明全文
含义。
ƒ能正确反映论文的关键内容。
ƒ尽量使用美国美国国立医学图书馆编辑的《Index Medicus 》中医学主题词表《MeSH》
内所列的词。
ƒ关键词的排位：前言之前
ƒ用原词而不用缩略词。通常不选用冠词、介词、连词、代词、情态动词，以及无检索
意义的副词、形容词。
②前言（引言、导言、绪言、序言）
ƒ简明扼要的介绍研究工作的来龙去脉及课题的概况、价值和意义。
ƒ开门见山的交待* 研究目的、范围和主要收获；* 历史背景及国内外现状；* 本研究
的设想、方法、理论根据、预期结果和意义。
ƒ不涉及研究中的数据或结论，减少与正文及提要的重复。
ƒ评价论文的价值要恰如其分。实事求是。
③材料与方法
ƒ临床研究：病例来源及选择标准，诊断及分型标准；一般资料（例数、性别、年龄、
职业、病程、病因、病理诊断依据、观察方法与指标等）；药物剂量、剂型等
ƒ实验研究：实验条件，包括动物名称、种类、数量、来源、性别、体重、分组标准与
方法、标本制备过程，试验与记录手段、方法；
ƒ引用方法要注明文献出处；已公知公用的，只写明方法名称。
ƒ一般实验研究用“材料与方法” ，调查研究用“对象与方法” ，临床实验用“病例与方法”
等。
ƒ材料中所用的试剂、生产厂家、仪器规格与型号、研究对象、实验观察、统计方法等要
交待清楚。
4、避免重复介绍陈旧过时的方法及无关材料。
①介绍“材料和方法”的意义
ƒ全面评价样本的代表性：样本是如何选取，对象是否按已确定的选择标准进行收集，是
否做到尽量“典型”，是否应遵循随机化原则分组。
ƒ了解样本的组间均衡性：（比较是科研方法中的重要手段），应遵循齐同对比的原则。
ƒ研究指标的精确性
②“材料与方法”中的主要问题
23
™基础研究类论文：动物模型形成过程介绍不清；实验步骤介绍不详细；涉及多种方法的
实验研究，各种方法介绍详略不一。
™临床研究类论文：缺少对象的选择标准；未给出诊断标准；治疗方法中药物剂量介绍不
详；缺少观察指标的描；随机分组情况说明不具体。
5、结果
是作者调查、观察或实验研究结果的结晶，是论文的核心部分，全文的结论由此得出，讨论
由此引发。结果是结论的依据，反映论文水平的高低及价值。
① 认真分析原始数据，数据表达要完整，从中揭示某些自然规律。
②根据内容的要求结合图表、文字的特点，有选择性地、按逻辑顺序在图表中描述研究
结果。
③如实反映科研假说中所设计的主要指标。研究结果中，只要是真实的结果，都不可随
意摒弃。
④列表：
• 重点突出、内容精练、栏目清楚，数字准确；
• 数字不多、栏目过繁、文字过多均不宜列表；
• 表、文、图内容避免重复；
• 列表均应有表序、表题；
• 栏目分项、层次要简明，主项（主语项、固定项）直左排，辅项（谓语项、活动项）
横上排；
• 以数字为主，文字从简，计量单位一致。
⑤统计学处理要真实可靠。
6、讨论
论文的精华部分，是对研究结果的科学解释与评价。是作者对实验观察结果的思考、
理论分析和科学推论，阐明事物间的内部联系与发展规律，揭示研究结果在理论与实践中的
意义，是作者学术思想的展示，论文水平的显示。（反映了作者的理论思维、学术素养、知
识的深度与广度、专业写作技巧）。
① 围绕研究目的、突出主题、抓住重点阐明研究结果及其结论的理论意义、指导作用和
实践意义。
② 着重讨论研究中新的和重要的发现，并从中得出结论。
③与国内外同类研究比较，突出研究的创新与先进之处，提出作者的观点与见解。
④实事求是地对研究的限度、缺点、疑点等加以分析和解释（因果关系、偶然性与必然性。
⑤展示有待解决的问题。
怎样写讨论
①讨论的内容：
ƒ紧密结合文中研究所获得的重要发现，以及从中引出的结论进行讨论。要尽可能地将本
文的结果提高到理论水平来认识，一要有事实，二要有理论，应理论与实践结合。
ƒ讲明实验条件，尤其是未控制的部分，未解决的问题，缺点更应当说明。
ƒ结合文献阐明自己的结果与他人的结果之异同，突出自己的新发现、新发明、新创造、新
观点。
ƒ 讲述因果关系，说明偶然性与必然性，以及本文的理论意义和实用价值。
ƒ介绍尚未定论之处，相反的结论，以及本文不足之处。
ƒ提出进一步研究的方向、展望、建议和设想
②讨论的禁忌：
* 禁忌长篇综述参考文献；
24
* 重复叙述结果；
* 报喜不报优，弄虚作假，隐瞒缺点；
* 循环推理，以假设来证明假设，以未知来求证未知；
* 泛泛之谈，空话连篇，缺乏新意；
* 极力贬低他人的成果，不能实事求是地评价自己的成果。
③结论：论文最后的总体结语，主要反映论文的目的、解决的问题及最后得出的结论。
* 进一步概括提炼主题；
*在充分论述的基础上，提出最后结论；
*提出问题，发人深思；
7、展望未来
要求简明扼要、精炼、完整、表达准确、有条理性。
8、致谢
致谢对象：*对研究方案和写作提纲提出建议、指导、论文审阅、修改者；
*资料提供者，技术协助者，帮助统计人员；
*提供实验材料、仪器以及实验样品等；
9、参考文献
为了标明论文中某些论点、数据、资料与方法的出处，供读者参阅、查找而引用的有关
文献，是论文的一个重要组成部分，有助于证实论文的科学性，也表示对他人研究成果的尊
重，便于文献检索。
特点与意义：
⑴继承性
⑵真实性
⑶准确性
⑷限制性
期刊
作者,.题名.期刊名称，年份，卷（期）：起止页
Goter MM, Pastn I . Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug
transporter , Annu Rev Biochem , 1993 ,62: 385.
陈林, 王玉.肝硬变门脉高压症病人肝组织中肾上腺素受体的变化。中华医学杂志，
1997，77（3）：175-190
第六节各种类型医学论文
一基础医学论文
探索自然界物质运动变化的基本现象及规律，通过研究认识新知识、发现新规律、创
新新原理。为发展新技术、研制新产品、开拓新方法或新的生产领域提供理论依据，乃至产
生划时代意义的科研成果。
* 选题
* 准备
* 撰写
二临床实验论文
以某种疾病的病人为研究对象，包括诊断和治疗两大部分( 以应用为目的，但又具有
基础学科的性质）。
三流行病学（病因、宿主、环境）论文
25
四护理学及中医药学论文
五实验研究论文
六文献综述论文
七医学生毕业论文（字数在2万左右）
是学生在即将完成学业时，从某个专题（或领域）表述自己的学术水平和学术成果的一
种文体；是教师或评审者对学生整个学业的一次检阅。
1、特点
⑴不可避免的局限性；
⑵一定的依从性
⑶专题性与全面性
⑷动态性：体现论文的生命力和先进性
学位论文具有两大功能：一是成果，即学位论文是对某个专题（或领域）表达自己的学术
水平和学术成果，具有一定价值；二是考核，学位论文反映与学位相称的能力、学识，是审
查者对作者学业及能力水平的全面检阅。
2、毕业论文撰写的基本要求
写作上要求更严谨的结构，；内容上要求较大的容量和文字上较长的篇幅以及学术上更高
标准。
（1）撰写的独立性要求；
（2）学术水平与学术价值的统一要求；
（3）实事求是评价；
(4) 讲究精湛的写作技巧
3、如何写好毕业论
⑴ 注意加强语言功底训练；
⑵ 养成多看、多思、多写的习惯；读书破万卷，下比如有神；要博观而略取
⑶ 善于补捉写作中的灵感；
⑷ 树立写作的信心、决心和认真求实的精神；
⑸ 打好理论基础，掌握专业知识。
4、硕士学位论文写作格式
（1）封面、封二、题名页
封面提供学位论文工作的概貌，包括题名，作者姓名及所属单位和专业名称、申请学
位级别、导师姓名及职称
封二一般列出论文指导小组成员的姓名和职称
（2）目录页
（3）摘要写法与科研论文相同，但是字数可适当增加，并附相应的英文摘要。为了便于
读者迅速了解论文内涵，并有利于提高标引质量，应列出3—8个关键词。
（4）前言对课题选择及其依据作简要的论证，对实验的设计、研究工作的范围和内容作必
要的说明。
（5）正文
材料与方法包括实验材料与实验方法
结果：此乃论文的核心
讨论：是论文写作最主要的表达形式，可充分反映作者学术思想的深度与广
度。写作中注意论点、论据、论证的紧密融合。
结论
参开文献
26
致谢
送请评审用的详细摘要（从事本课题研究的目的和重要性；研究的内容和过程；获得的主要
结果，应突出论文的新见解，研究结论与意义）。
• 前言：对课题的历史及其现状进行叙述
• 材料与方法：详细将仪器、方法、步骤及计算写出
• 结果：如实写出
八综述
1、以某一专题为中心，收集大量的原始医学文献，经过消化、分析、归纳、综合、整理而
写成的一种专题性的学术论文，其内容常包括历史性回顾、目前状况、争论焦点、存在问题、
未来展望和最新进展
2、撰写文献综述是积累、理解和传播科学资料，培养组织材料、提高科学思维能力的途径，
是做好科研工作的必经之路，它有助于科研工作的各个环节。因此，科研工作者在查阅文
献之后，实验设计之前，最好完成一篇有关问题的文献综述
3、文献综述的特点：综合性、新颖性和融合性。
4、文献综述的分类：
（1）动态性综述：内容安排上的特点是：时间顺序严格，着重介绍
历史阶段性的成就，关键是学科发展阶段要准确。重点选择每
一个阶段有代表性的文献。
（2）成就性综述介绍某一方面某一项目的新成就、新技术、新进展。
此类综述颇有实际价值，对当前工作有指导意义。
（3）学术观点争鸣性综述：系统地总结出几种学术观点，由作者加
以分类、归纳和总结。要用原文的事实和观点，作者的概括和
分析较少
（4）综合简介性综述：概括多方面的事实、现象，对某一问题，
某一种疾病的文献资料进行综合的叙述，完全不考虑时间顺序，
只是按照内容本身的特点，加以分段安排。
5 、格式：一般由前言、主体、结尾和参考文献四部分组成。
（1）前言提出问题，点出主题并指出意义，加上大致的学术背景。
文字以100—200字为宜。
（2）主体部分说明主题所提出的问题。根据文章的性质，可再分段
落或再加小标题，每一段落或小标题下面都是从不同侧面、不同
层次上解释题目的中心内容，且各段落之间各有分工并保持内在
联系。主体部分每一段落开始，应该是综合提炼出来的观点，即
论点，接着是继往文献提出的实验结果或调查事实，即论据。
（3）结尾部分把文章的结论再概括，精炼地进行明确
（4）参考文献要求有近年的参考文献
6、写作前准备
对本课题的研究动态、发展方向、研究水平都已了如指掌。
⑴ 准备材料
⑵ 精心命题
27
⑶ 写好提纲
7、写作阶段
⑴在引言上下功夫
⑵观点和材料统一运用
① 要防止材料堆砌。
② ②要注意“一边倒”的倾向。
③ ③要禁忌空泛议论。
④ ④要注意“分寸”。
⑶写好结论
要求：做到四贵㈠贵“新” ；㈡贵“奇” ；㈢贵“深” ；㈣贵“精”
第七讲医学研究的经费来源与课题的申请
第一节我国医学科经费的来源
一国家级项目：
（1）国家科技攻关项目；
（2）国家自然科学基金；
（3）国家973和863项目；
（4）国家科技部项目；
（5）国家计委项目；
（6）攀登计划项目
二部委级项目：
（1）卫生部科学研究基金；
（2）卫生部项目;
（3）人事部项目；
（4）教育部项目;
（5）国家计划生育委员会项目;
（6）药品管理监督局项目;
（7）国家中医药管理局项目
三自治区基金：
(1) 自治区自然科学基金；
(2) 卫生厅项目；
(3) 教育厅项目；
(4) 财政厅
四盟市资金
五国外基金项目世界卫生组织,联合国儿童基金会,美国中华医学基金会.
六个人自筹资金
今后15年是我国经济、社会发展的关键时期。国家将以医药生物技术为突破口，重点资
助重点研究领域
* 基因工程药物和疫苗，
* 重要疑难病基因治疗技术
28
* 人口控制
* 新药创制
* 疾病防治
* 污染控制
* 资源开发、防灾、减灾等。
™国家自然科学基金主要来源：
™主要用途：研究经费、管理费、国际合作、学术交流、支持优秀青年的研究工作
™资助范围：面向全国
™科学基金包括三个层次、七个基本类型
™三个层次：面上项目
重点项目
重大项目
™七个基本类型：
自由申请项目
青年科学基金项目
地区科学基金项目
重点项目
重大项目
主任基金
专项基金项目
1、面上项目
（1）自由申请项目
（2）青年科学基金
（3）地区科学基金:内蒙古、宁夏、青海、新疆、西藏、广西、海南、云南、贵州、江西
等。资助特点：接合当地条件和特点的研究项目。
2 、重点项目
™ 资助范围：
（1）学科布局中关键问题及对学科发展有重要推动作用的学科前沿；
（2）对国民经济、社会发展有重要应用前景和带动作用的研究领域；
（3）能充分发挥我国资源或自然条件特色的研究领域。
①有先进的研究目标，明确的科学问题，创新的学术思想，合理的研究方案以及必要
的实验研究条件；
②有高水平的、活跃在科学前沿的学术带头人和精干的研究队伍
③项目有国内领先的研究工作基础，近期可望取得重要成果或突破性进展等；
3、重大项目
™ 主要资助：
① 科学发展中具有战略意义，我国具有优势，可望取得重大突破，达到国际先进或领先水
平的前沿性基础研究。
② 国家经济发展亟待解决的重大科技问题、对开拓发展高新技术产业具有重要影响或有重
大应用前景的基础性研究。
③ 围绕国家可持续发展战略目标或为国家重要宏观决策提供依据的基础性研究，以及具有
广泛深远影响的科学数据积累等基础工作。
资助对象：
™ 近期可望取得重大突破的研究前景。
29
™ 针对一个综合性科学问题，紧密围绕项目总体目标，相互配合、有机联系的课题组
成。
™ 有学术造诣高、组织能力强、能率领研究队伍并拓创新的学术带头人和相应的研究
队，形成国家水平的研究队伍
™ 资助特点：鼓励联合研究
4、专项基金
I. 国家杰出青年科学基金
II. 国家基础科学人才培养基金
III. 高技术新概念、新构思探索课题专项基金
IV. 优秀国家重点实施研究项目基金
V. 数学天元基金
›申报条件
（1）符合科学基金的资助范围，有重要科学意义，有重要应用前景。
（2）研究项目的学术思想新颖，创新性强，立论根据分，研究目标明确具体，研究方法和
技术路线合理、可行，可获得新的科学发现或取得重要进展。
（3）有稳定的研究队伍。
（4）经费预算实事求是。
（5）申请者必须是项目的实际主持人。
（6）申请者和具有高级专业技术职务的项目组主要成员的申请不超过两项。
（7）申请手续必须完备，所需资料必须齐全。
（8）已承担项目结题。
（9）在读研究生、兼职科研人员不得作为申请项目负责人提出申请。受理时间与资助期限，
自2月15日开始，3月31止，资助期限期限一般为3年。
5、主任基金
第二节医学科研课题申请书的撰写
填写标书前准备
充分占有文献资料，熟悉本领域的国内外最新进展
结合自身特点，提出研究目标
要充分重视所提问题的创新性
注意：课题名称所反映的内容必须与申报内容相符。
简明：不繁赘冗长
具体：明确清晰，不抽象笼统
新颖：创新。
醒目：文字精湛传神，引人入胜。
(一) 课题名称的拟定
‰ 原则：简明、具体、新颖、醒目，并能确切反映课题的研究因素、研究对象、研究内容、
研究范围及互相间的联系。
例<细胞凋亡与糖尿病视网膜病变发病机制>
研究因素: 细胞凋亡
研究对象: 糖尿病
研究内容: 糖尿病视网膜病变发病机制
研究范围: 从细胞凋亡角度研究,属基础研究
30
<无偿献血者肝炎指标检测结果及不同性别与血型差异分析>
修正后< 无偿献血者肝炎指标检测结果及相关因素分析>
(二) 简表的填写
申请书主要内容和特征的概括表达
1、研究项目的基本特征和申报特征
(1) 项目名称：
(2) 研究类型：基础研究、应用基础研究、应用研究、发展或开发研究。
(3) 申报项目类别：各归口部门所公布的项目类别。
（4）申报学科：填写申请项目所属的最基础学科
注意：申报学科要与申报课题的内容相符
要了解所申报学科的资助特点( 主要资助内容及主要资助对象)
(5) 学科代码：
(6) 申请金额：以万元为单位
(7) 起止年月：一般重点、重大项目研究年限为3-5年，其他为3年。
(8) 所用实验室
2、申请者的基本情况
(1) 所在单位名称及代码
(2) 隶属关系
（3）单位所在地
3、项目组成员的构成及分工
(1) 参加单位数
(2) 项目组主要成员
(3) 项目中的分工：指项目组成员具体承担的工作和时间
(4) 签章
⑸身份证号码
4、研究内容和意义(160-250字)
使用的主要方法、研究内容、预期结果、理论意义及应用前景。
主题词数目不多于5个。
(三)立论依据的撰写
反映：
* 你是否熟悉该研究领域的进展
* 是否真正理解所研究的问题
* 资料掌握的是否全面
* 学术思想是否宽广
* 立项是否可靠
立论依据一般包含内容
• 介绍本课题的研究背景
• 介绍本课题的研究现状、水平和最新技术成就
• 介绍本课题当前国内外研究的动向和趋势。
• 要表明自己的创新点
• 阐明将使用何种技术条件和实验手段；
• 研究工作将会在理论或实际应用中解决什么问题，将会给本领域贡献什么？增加哪
些新知识？对学术理论或国民经济和社会发展起到什么作用及具有多大价值；
• 列出引用的主要文献。
31
Attention
• 格式清晰，逻辑合理
• 对国内外研究现状的分析要全面、透彻；对提出的研究目标要合理、适当、避免太
分散
• 对理论依据的推测和假设必须严谨、科学；
• 语言要科学、准确，切忌含糊
(四) 研究方案的撰写
1、研究目标、内容和拟解决的问题
(1)研究目标：通过研究要达到的具体目的，是项目申请的精髓：准确、具体、明确、可行.
• 阶段目标
• 最终目标
• 目标
Attention 是课题的核心及靶子；
是课题要解决的问题；
是课题完成后具有显示度的内容
常见错误
• 目标概念不明确
• 目标与选题脱节
• 目标内容不明确或没有填写
• 目标过多无的放矢，目标过大无法实现
• 预期水平笼统，缺乏根据
• 忽视学术进步和科学价值的阐述
ƒ 社会效益空泛，经济效益计算不确切等
(2) 研究内容（课题研究的范围、内容和可供考核的指标）
‹ 注意：
1. 你准备从哪几个方面的研究来论证提出的问题。
2. 明确从哪个角度、哪些范围、哪个水平进行研究
3. 每个方面或分题计划选择什么样的可供考核的技术或经济指标。
(3) 拟解决的关键问题：
整个研究过程中的主要技术环节，关系着整个实验成败的核心技术问题等。
2、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
A. 研究对象：* 临床试验对象
* 实验动物
Attention 敏感性；特异性；稳定性; 病理强度；标准化；集中化；代
表性；
要正确估计样本大小
B. 技术路线：指具体实验中的技术路线及进行实验的程序和操作步骤。
C. 实验方法
D. 数据的采集和统计方法
E. 可行性分析
临床实验对象
• 诊断标准；
• 纳入标准；
• 排除标准；
32
• 选取的例数和分组及分组的原则，名称和方法，各组治疗方案；
治疗的疗程及剂量,不良反应控制和记录等
实验动物
种属；品系来源; 性别；体重；
月龄及一般条件；
分组的原则、名称和方法
注意
• 造模方法和成功的标准
• 实验给药方法；
• 实验所用剂量；
• 反应处置；
• 如何纪录等
撰写时常出现的问题
• 标准陈旧或缺失
• 对照组设置不合理，不具有可比性
• 观察效应指标针对性不强，技术路线缺项或过于简单，或不具有可操作性
• 研究方案与研究目标不一致
• 借口保密，不讲述关键问题，或故责玄虚，以假充真
• 方法陈旧，无创新或不适于研究内容
• 对新方法、新技术或改进的方法叙述不详细，或不能提供可行的信息。
• 掩饰可能出现的问题或提不出解决措施或缺乏科学性。
3.本项目的创新之处：选题、设计、方法、技术路线、成果、应用等方面与众不同之处。
4.年度研究计划及预期进展：根据课题技术路线对研究内容作阶段性的安排。
5.预期研究结果：
(五)研究基础的撰写
a) 研究工作基础：工作积累和成果
b) 实验条件：已有条件：仪器、试剂、实验动物等；尚缺少的条件和拟解决的途径。
c) 技术条件
（六）经费预算的填写
（１）科研业务费
（２）实验材料费
（３）仪器设备费
（４）实验重改装费
（５）协作费
（６）项目组织实施费
问题：
经费额度过高
预算项目过于简单或不全面
无计算根据和理由
计算错误
Attention 基础研究项目：重在结合国际上本学科领域内的发展动态,论述项目的科学意义及
创新的学术思想；
应用基础研究项目：重在结合学科发展的同时,围绕我国国民经济和社会发展中的重要科技
问题,论述其潜在的应用前景
33
专家对项目的评价
１. 对科学技术、生产实践的意义及应用价值
对推动某一学科的发展有重要意义和应用价值，有一定指导意义术意义不明显，理论或技术
上无明显意义和价值
2. 理论创新
9 发现新规律、新现象、在理论上有较大创新
9 发现一定意义的新规律
9 补充前人发现的规律、现象、理论上有一定创见
9 重复他人研究结果，未发现新规律，新现象
3. 学术水平
¾ 国际领先或先进水平
¾ 国内领先或先进水平
¾ 区内领先水平
¾ 区内先进水平
4. 难易、复杂程度
ƒ 难点多、复杂、难度大、涉及学科多
ƒ 难点较多、较复杂、难度较大、涉及学科较多
ƒ 难点不多
ƒ 难点少
5．科学性、系统性、完整性
‹ 研究思路、方法、技术路线、实验方案系统、完整、严密、可行
‹ 比较完整
‹ 一般
‹ 较差
实例
细胞凋亡与糖尿病视网膜病变发病机制
1、立论依据
（１）简介：糖尿病视网膜病是世界致盲的主要原因之一，在我国呈增长的趋势。
（２）目前的状况及自己的创新: 尽管30多年来同内外学者努力研究周细胞出现选择性死
亡机制，但没有重大突破，因此，在防治糖网病上束手无策。
（３）国内外的研究
概括起来已形成两大理论。第一是高糖造成的“可逆性代谢障碍”，第二是“高糖造成
的不可逆的代谢障碍”。目前的理论仅能解释为什麽患糖网病时周细胞增殖活力降低以及高
糖记忆性损伤作用，但不能解释为什麽在临床上快速控制血糖可引起或加剧糖网病的发展。
（４）本实验室最新的结果表明糖的波动可引起周细胞死亡，而不是持续高糖引起周细胞死
亡。另一方面，周细胞凋亡的程度与原高糖的程度和时间密切相关。更重要的是，我们使用
蛋白合成抑制剂和生长因子的作用，可大大延缓周细胞凋亡的过程，展现了逆转周细胞死亡
和治疗糖网病的前景。
2、研究目标、内容、拟解决的关键问题
研究内容和拟解决的关键问题
（１）高糖所造成的代谢紊乱是如何决定周细胞必然要进入凋亡程序，而在相同条件下为什
么内皮细胞却得以存活
（２）比较周细胞与内皮细胞中多种信息传递通路和凋亡相关基因表达，从而解释选择性周
34
细胞凋亡。
主要拟检测：
(1) 细胞内Ca2+的变化
(2) 蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶A(PKA)的活性。
(3) PKC异构酶的表达.
(4) 凋亡抑制基因BC1-2，凋亡激活基因bax,肿瘤抑制基因P53和C-myc mRNA表达和它们
的蛋白产物.
(5) 控制糖浓度的波动，调控相应信息传递通路和凋亡相关基因是防止周细胞死亡的方法.
(6) 合理地、缓慢地控制糖水平的升降
3、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案、可行性分析
⑴ 视网膜毛细血管周细胞和内皮细胞培养，按过去实验方法进行
⑵ 周细胞与内皮细胞复合培养（见附表）
⑶ 细胞凋亡的形态学和生物化学指标按过去方法
⑷ NAD+和ATP测定按Grant和Ericson法
⑸ 胞内钙浓度按过去方法
⑹ PKC活性和异构酶的测定按Inoguch和King法。
⑺ cAMP—依赖性PKA按Kammer 法
⑻ 凋亡相关基因bc1—2、bax，P53和c-myc 将用RT-PCR方法进行。
⑼ bc1-2，bax，蛋白水平将用酶标法测定，抗血清可由Bection，Dickmson Lab.购到
以上实验方法在本实验室均已成熟，且周细胞、内皮细胞存活的病理模型已经建立。本
实验室有良好的设备，估计可以按计划完成。
4、创新之处
① 首次建立了糖尿病条件下选择性周细胞死亡的病理模型，提出并验证了周细胞死亡方式
是凋亡。
② 第一次提出了“血糖波动”比“持续性高糖”对周细胞存活具有更大的危害。本课题一改过
去国内外20余年只注意高糖毒副作用的研究方向。
③ 本课题是周细胞与内皮细胞的比较性研究，包括两种细胞复合培养。
④ 首次提出用调控血糖，调控凋亡相关的信息传递通路和凋亡相关基因表达等方法揭示
临床治疗早期糖网的前景。
5、年度研究计划、预期进展
预计用三年时间完成
① 在高糖条件下二种细胞内的醛糖还原酶被激活，糖基化终末产物形成，同时NAD+，ATP
水平、DNA链裂水平和DNA蛋白交联水平发生变化，但变化程度可能不同，这些将作
为判断细胞“命运”的指标。
② 糖浓度骤然波动可能造成胞内Ca2+浓度升高，有可能激活一系列Ca2+依赖型酶的活性。
③ 与细胞死亡和细胞增殖相关的PKC和PKA，是相互对立，又相互关联的信息传递道路，
糖骤然波动后两种细胞内PKC、PKA通路的状况可能与细胞存活或死亡有关。
④ 凋亡相关基因的表达和产物的水平----Bc1-2/Bax蛋白的比例在两种细胞中可能不同，通
常Bc1-2/Bax比例高细胞不会死亡，我们预计根据Bc1-2/Bax比例可以解释为什么一种
细胞存活而另一种细胞尚可存活的现象。
⑤ 在上述(1)-(4)的各种条件下，使用信使(Ca2+、PKC、PKA)抑制剂或激活剂，使用蛋白
合成抑制剂，RNA合成抑制剂以及生长因子，为“体外疗法”，同时观察上述指标，判断
“体外疗法”治疗周细胞凋亡的效果。
35
第九讲科研方法实习指导
第一节细胞培养基本知识
一、什么是细胞培养？
组织或细胞培养是指从动物活体体内取出组织，模拟体内生理环境，在特定的体外条件
下使其生存并生长。若以产生形成培养物的方法而言，可分为组织培养、细胞培养和器官培
养。
组织培养指把活体的一小片组织置于底物上孵育，细胞在适当的条件下增殖、生长。
细胞培养是把取得之组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，再进行培养生长。
由于这些培养物的主要成分均属细胞，而这些细胞在体外生长时，仍然是相互依存、互相
影响的。因此，细胞培养和组织培养实际上区别不大。
器官培养，系将活体中器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的
结构和功能特征。
二、组织或细胞培养的主要优点
㈠研究的对象是活的细胞。
在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至定量评
估一部分活细胞的情况，包括其形态、结构和生命活动等。这点是其他方法所无法取代的。
㈡研究的条件可以人为的控制。
进行体外的细胞培养实验时，可以根据需要，通过控制PH、温度、O2张力、CO2张力等物
理化学的条件进行实验、观察。
㈢研究的样本，可以达到比较均一性。
通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞，可以达到均一性。需要时并可采用克
隆化等方法使细胞达到单一化。
㈣研究的内容便于观察、检测和记录。
通过倒置相差显微镜、电视、电影等直接观察活的细胞；电子显微镜分析细胞的超微结
构；同位素标记、放射免疫等方法检测细胞内物质的合成、代谢的变化等。
㈤研究的范围比较广泛。
细胞培养可在多种学科均可利用进行研究，如：细胞学、免疫学、肿瘤学、生化学、遗
传学、分子生物学等。可供实验的组织来源众多，包括各种动物的各类组织，可以是动物的
胚胎或成体，可以是正常组织或肿瘤组织等。
㈥研究的费用相对较经济。
细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的实验样本，因此有时可比体
内实验经济的多。例如，一个需要 100 只鼠才能得出结论的实验可能用 100 片盖玻片或几个
多孔培养板而获得具有相同统计学意义的结果。
细胞培养虽然具有很多优点，但也存在一定的不足。首先，对于体外培养的细胞，应该
把他们视作一种既保持动物体内原细胞一定的形状、结构和功能又具有某些改变的特定的细
胞群体，而不能将之与体内细胞完全等同。其次，细胞培养存在一定的不稳定性，尤其是反
复传代、长期培养者，有可能发生染色体非二倍体改变等情况。另外，细胞培养对人员、设
备等条件都要求较高。
三、细胞培养的应用
㈠病毒学
近年来病毒学中很多发展与能在培养细胞中生长病毒的技术有关。由于很多病毒疾病可
用抗体血清治疗，因此需要能够生长大量病毒以用于产生疫苗及鉴定，这些工作常可利用培
36
养的细胞进行。
㈡免疫学
杂交瘤-单克隆抗体技术极大的促进了免疫学的发展，而这种技术就是在细胞培养技术的
基础上发展起来的。
㈢遗传学
可以利用细胞培养技术进行染色体分析。细胞融合技术与遗传学技术相结合建立了体细
胞遗传学，已成为包括人在内的高等脊椎动物遗传学分析的一个重要的组成部分。
㈣肿瘤学
细胞培养技术已广泛应用于肿瘤学的领域，促进了对肿瘤的了解。例如：利用细胞培养
进行的细胞转化作用改变细胞原来的性质，被认为是研究肿瘤发生的良好方法。
㈤分化及发育
高等动物真核细胞分化的研究是比较困难的。现在利用体外培养对分化进行研究，例如：
经一已知的外界因素刺激后有些细胞群体可发生改变，这些改变可以被确认并进行监测，可
研究细胞分化及发育过程中相互作用及细胞内控制的机制。
㈥细胞毒试验
在细胞培养技术的应用中，日益广泛的是进行多种物质的毒性试验。
㈦临床医学及生物技术方面的应用
例如：从子宫取得细胞作染色体分析可揭示尚未出生胎儿的遗传性疾病；在合适的宿主
细胞的培养可做病毒感染的定性及定量分析；以细胞培养作克隆、微量分析或其他体外监测
分析方法检测药物的效应；经体外刺激生长的淋巴细胞可用以改善对肿瘤的免疫反应、LaK
细胞的应用等。
四、培养细胞的生长方式及类型
㈠贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有
一些难以确定其稳定形态的细胞。
㈡悬浮生长型细胞
不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
五、培养细胞的生长过程
㈠单个细胞的生长过程：细胞周期
细胞周期可分为间期和 M 期（分裂期）两个阶段。
间期=G1 期+S 期+ G2 期
细胞周期=间期+M 期= G1 期+S 期+ G2 期+M 期
G1 期：DNA 合成前期（细胞分裂后期） S 期：DNA 合成期
G2 期：DNA 合成后期（细胞分裂前期） M 期：有丝分裂期
㈡细胞系的生长过程
体外培养细胞寿命的过程一般可分为三个阶段。
1、原代培养或初代培养期：为新鲜组织自体内取出并在体外培养生长至第一次传代的时
期。
2、传代期：原代培养的细胞生长一定时间之后，如贴附型细胞即融合成片而逐渐铺满底物
的表面，此时，便应将原代细胞分开接种至 2 个或更多的新的培养器皿中，即传代，此
即成细胞系。
3、衰退期：一般有限细胞系在此期的细胞开始时虽仍然存活，但增殖已很缓慢并逐渐完全
停止，进而细胞发生衰退死亡。
㈢每代细胞的生长过程
37
原代细胞传代后即为细胞系。细胞自接种传代至新培养皿中至其下一次再传代接种的时
间为细胞的一代。每代细胞的生长过程可分为三个阶段：
1、滞留期：当细胞接种入新的培养器皿，不论是何种细胞类型、其原来的形态如何，此时
细胞的胞质回缩，胞体均呈圆球形。先悬浮于培养液中，短时间后，那些尚可能存活的细胞，
即开始附着于底物，并逐渐伸展，恢复其原来的形态。在经过一潜伏期，此时细胞已存活，
具有代谢及运动活动但尚无增殖发生。以后出现细胞分裂并逐渐增多而进入指数生长期。一
般细胞滞留期的时间不长，约为 24~96h。肿瘤细胞则更短，可少于 24h。
2、指数生长期：此期细胞增殖旺盛，成倍增长，活力最佳，适用于进行实验研究。此期时
间的长短因细胞本身特性及培养条件而不完全相同，一般约可持续 3~5 天。
3、平台期：有称生长停止期。此期可供细胞生长的底物面积已被生长的细胞所占满，细胞
虽尚有活力但已不再分裂增殖。若及时分离培养、进行传代，将细胞分开接种至新的培养器
皿并补充以新鲜培养液，细胞将于新的培养器皿中成为下一代的细胞而再次繁殖。否则，若
传代不及时，细胞将因中毒而发生改变，甚至脱落、死亡。
六、培养细胞生长的条件
体外培养的细胞需要合适的环境和必需的条件才能生存繁殖。
㈠细胞的营养需要
1、基本营养物质：体外培养细胞的生长必需一些基本的营养物质，包括氨基酸、维生素、
碳水化合物及一些无机离子。
2、促生长因子等物质：体外培养细胞既需要上述基本营养物质，还需要促细胞生长因子等
物质才能正常生长、繁殖。血清中含有多种这类物质，有利于多数细胞的存活和生长，
但同时也有些组成不明、对细胞有害的成分。
㈡细胞的生存环境
1、温度：体外培养的细胞需在保持一定恒温的环境中才能生长。哺乳动物包括人类体外培
养细胞的理想温度是 35~37℃。培养温度如不适当，将会影响细胞的代谢及生长，甚至
发生死亡。一般说，高温比低温对细胞的影响更为明显。
2、气相及PH：体外培养细胞采用开放培养时，其气体环境一般应为 95%空气加 5%CO2的混合
气体。CO2为细胞生长所需要，同时又是细胞代谢的产物，并与维持培养基的PH有关。大
多数细胞适于在PH7.2~7.4 条件下生长。一般来说，细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，
偏酸的条件比偏碱的环境对生长有利。
㈢无污染及无毒
体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境。无毒是培养细胞的必需条件。凡与细
胞直接或间接接触的东西都必须是无毒的。
细胞培养中的污染问题包括细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及其他有害
物质的污染。这些是细胞培养工作中要非常重视的问题。可能导致微生物的污染包括细菌、
霉菌及支原体。
第二节 Beckman DU-640 系列紫外分光光度计之原理及应用
一、原理
紫外分光光度分析法，是依据物质分子或离子团对紫外的特征吸收而建立起来的分析方
法。
我们应用的主要范围在紫外区和可见光区。将不同波长的单色光依次通过被分析的物
质，分别测到不同波长下的吸光度或透光率，以波长为横坐标，以物质对不同波长的光的吸
光度为纵坐标，即绘成该物质的吸收光谱曲线，称光谱图。
38
DU-640 系列紫外分光光度计的测定波长范围为 190~1100nm，设有三种常规测量功能，即
固定波长分析、全波长扫描和时间动力学测定。核酸分析
㈠原理：
由于核酸通常和蛋白以核蛋白的形式结合，所以在提纯核酸的过程中，要测定其中蛋白
质杂质的含量。通过两个波长（260nm/280nm）的吸收读数比率和空白的校正，即可估算核
酸的纯度。DNA 比值为 1.8，RNA 比值为 2.0。对核酸来说，260nm/280nm 的比值越小，说明
蛋白杂质越多，两个波长吸收比率小于所规定的最小值，则核酸纯度不符合要求。
常涉及到用于测定核酸样品的波长有 4 个。
a.230nm：肽键的吸收波长，用此波长检测蛋白质的含量比 280nm 处更灵敏，但常用缓冲液
（如 Tris 等）对测定有干扰。
b.280nm：蛋白质中芳香族氨基酸的吸收波长，由于干扰少，被经常使用。
c.260nm：专用来检测核酸的含量。
d.320nm：用于本底校正，核酸和蛋白在此波长下无吸收，一些干扰因素（如散射光）可产
生吸收，故常用于本底吸收波长。
㈡分析举例：
测定核酸样品在有本底校正时的 260nm/280nm 的比率。
操作：在核酸分析窗口，用鼠标器打开分析类型[Assay typt]，选择[260nm/280nm Ratio：
Bkg=320nm]项，在取样装置[Sampling device]项中选取取样方式为[None]，仪器即可进入
分析状态。在此测定方式下，可同时获得样品在 260nm 和 280nm 处的光密度及 260/280 及
280/260 的比率。
由于在实验室制备的核酸样品很宝贵，此时可选用与仪器配套的 50μι比色杯，可用极
少的样品进行测定。
二、蛋白质分析
蛋白质的定量分析是生物化学和其他生物学科、食品检验、临床诊断等领域中最常涉及
到的分析检测
手段。由于蛋白质种类很多，分子组成、结构、分子量差别很大，功能各异，因此目前测定
蛋白质含量的方法很多，各有其特点，在了解每种方法特点的基础上，选用适用于自己试验
的方法。
本仪器采用 Biuret，Bradford，Lowry Hs，Lowry Ls，UV 法，BCA，Collooidal Gold，
Usre defined 等 8 种最常用的测定蛋白质的方法程序化，只要将选定的方法调出，其余各
种计算均由软件自动完成。计算结果既迅速又准确。
㈠ Biuret（双缩脲法）
原理：双缩脲反应，肽、蛋白质与二价铜离子在碱性溶液中形成紫色络合物，最大吸收
波长在 540nm，可测定含 10~1200μg/ml 蛋白质的样品，标准曲线的线性关系和重复性都较
好，但灵敏度较差，低于 Lowry 法和直接 UV 法。
㈡ Bradford（考马斯亮兰 G-250 染色法）
原理：考马斯亮兰 G-250 在酸性溶液中为棕红色，它和蛋白质通过疏水作用结合后产生
颜色反应呈蓝
色。在 595nm 处有最大光吸收，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm 的吸收值成正比，测
定蛋白质浓度范围为 1~140μg/ml，几乎无测定干扰，灵敏度是 Lowry 法的 4 倍。
㈢ Lowry（包括高灵敏度 Lowry Hs，低灵敏度 Lowry Ls 两种方法）
原理：蛋白质先与碱性铜试剂反应，测定形成蓝色络合物的吸光度，蛋白质浓度低于
25μg/ml 的样品用波长 750nm 测定，即 LowryHs 法；高于 25μg/ml 的样品用波长 500nm
39
测定，即 Lowry Ls 法。该方法的灵敏度比在 280nm波长下测定高 10~20 倍，是 Biuret 法
的 100 倍。
㈣ UV 法（紫外法）
1、原理：利用蛋白质因含有酪氨酸，色氨酸（有苯环共轭双键）的特点。在 280nm 处有一
吸收峰，光吸收值与其蛋白浓度成正比。但不同的蛋白质由不同的氨基酸组成，所以这仅仅
是一种近似的方法，除非制作标准曲线的蛋白质和样品的蛋白质是一样的，此法的灵敏度低
于任何一种方法。多用于柱层析分析中。
㈤ BCA 法
1、原理：用BCA试剂与Cu
+
特异结合的特点，在碱性溶液中，蛋白质将Cu
2+
还原成Cu
+
，后
者与BCA形成紫色复合物，为一种水溶性的盐，在 562nm处有很强的吸收，强度与蛋白浓度
成正比。标准法适用于蛋白浓度在 20~1200μg/ml范围内的样品分析，而微量法适用于浓度
在 0.5~20μg/ml范围内的样品，用非线性标准曲线可进行全范围测定。
㈥ Collooidal Gold（胶体金法）
原理：蛋白质与胶体金亲和，光吸收在 595nm 处，可测出范围为 5~200μg/ml 的蛋白质含量。
㈦ Usre defined 法（用户自行设定分析波长）
用户根据自己测定蛋白质的特许需要，自行设定分析波长等参数，只要将自行设计的方
法调出，即可以像上述其他方法一样使用。
第三节毛细管电泳/电色谱
一．概述：色谱现象从二十世纪初由俄国植物学家 Tsweet 发现并逐渐发展有了非常大的规
模，其分类越来越细，已经成为分析化学领域中发展最快应用最广的分析方法之一。
因为色谱法具有分离与分析两种功能，能够排除组分间的相互干扰，逐个将组分进行
定性、定量分析，而且还可以制备纯组分。因此在药物分析方面具有极高的应用频率。
二．基本概念及参数
1．电泳：电介质中带电离子在电场作用下以不同的速度向电荷相反方向迁移的现象。利用
这种现象对化学/生物化学组分进行分离分析的技术称之为电泳技术。
2．毛细管电泳（capillary electrophoresis,CE）, 泛指在极细的毛细管内实现的一大类
电泳技术。是以毛细管为分离通道以高压直流电为驱动力的新型液相分离分析技术。
3．高效液相色谱：（high performance liquid chromatography，HPLC）：以高压泵为流动
相驱动力，以细粒径的固定相微粒填充到分离柱中。溶质根据它们在流动相与固定相中
分配系数不同得以分离的一种高效微分离技术
4．毛细管电色谱：将 HPLC 中固定相微粒填充到毛细管中，以电渗流或电渗流与高压泵结
合为流动相驱动力，溶质根据它们在流动相与固定相中分配系数不同和自身电泳淌度的差异
得以分离的一种新型高效微分离技术。
40
图 1: CEC 结合了两种高效的分离技术——CE 和 micro-HPLC.
HPLC 是用压力驱动流动相，流速是随填充微粒的大小和柱长而变化的。流体在柱管
中呈抛物线轮廓（见图 2），因而造成了色谱峰谱带的展宽，降低了柱效。而 CEC 采用
了电场推动流动相，其线速度与柱管直径和填充微粒的大小无关，流体在毛细管中呈塞
状（见图 2），因此在 CEC 中几乎没有流速梯度，谱带展宽效应相应的就十分小。正是
基于上述原因，CEC 的分离效率明显高于 HPLC。
图 2：在 CEC 和 micro-HPLC 中流体的轮廓比较
5．色谱流出曲线：即色谱图，是样品被流动相冲洗，通过色谱柱，流经检测器，所形成的
浓度信号随洗脱时间变化而形成的曲线，称为色谱流出曲线。（简称流出曲线），即浓度-时
41
间曲线。
6．基线：当没有样品进入色谱仪检测器中或有样品通过，但其浓度变化不能被检测器所检
测时，所测出的流出曲线称为基线（base line）.○1.正常基线：应为一条平行于横轴（时
间轴），基线反映仪器及操作条件的恒定程度。基线的高低反映检测器的本地高低。主要有
流动相中杂质等因素决定。○2噪声：各种未知的偶然因素引起基线起伏的现象称为噪声
（noise,R）R 的大小可用噪声带（峰-峰值）的宽度来衡量。通常记录 1h 的极限，取噪声
带的最宽处来衡量噪声 R 的大小。单位 mV。
7．保留时间：从进样开始到某个组分的色谱峰顶的时间间隔，称为该组分的保留时间
(retention time,tR)。即从进样后某组分出现浓度极大点的时间间隔。
8．死时间、调整保留时间：不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间。保留时间减去死时
间即为调整保留时间。
三．基本原理
CE 的基本原理就是电泳与色谱。
电泳：亦叫电迁移，表现为介质的导电。
色谱：○1色谱法的产生由来○2指物质因在两相中分配并运动而发生分离或层析的现象。/它
利用混合物中各组分在两相间分配系数的差别，当溶质在两相间做相对移动时，各物质在两
相间进行多次分配，从而使各组分得以分离。分配系数大的组分迁移速度慢，反之迁移速度
快而被分离。现在常指运用这一现象进行物质分离分析的技术手段。
四．色谱法的特点、优缺点：
1．特点：高超的分离能力，其分离效能远远高于其他分离技术如：蒸馏、萃取、离心等。
2．优点：1.分离效能高。2.应用范围广它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是
有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分
离和分析。3.分析速度快一般在积分中到即使分钟就可以完成一次复杂样品的分离和
分析。4.样品用量少用及少的样品就可以完成一次分离和测定。5.灵敏度高如GC可以
分析几纳克的样品，火焰离子化检验器（FID）可达 10
-12
g/s，检测限为 10
-9
g/s。6.分离
和测定一次完成可以和多种波谱分析仪器联用。7.易于自动化分离和分析自动完成，
可以在工业流程中使用。
3．缺点：对所分析对象的鉴别力是较差的，一般来说色谱的定性分析是靠保留值定性，但
在一定的色谱条件下，一个保留值可能对应多个化合物，所以色谱方法要和其他方法配
合才能发挥更大的作用。
五．毛细管电色谱法的分类
填充毛细管电色谱法：将细粒径固定相填充在毛细管柱中
开管毛细管电色谱法：把固定相的官能团键和在毛细管内壁表面上而形成的色谱柱。
六．应用
（一）在环境分析中的应用：主要是环境污染物
（二）在生物医学分析中的应用
1．蛋白质分离分析结构鉴定
2．核酸及其碎片分析：核酸成分：核苷酸、核苷、碱基的分析。
核酸片段；核酸序列分析
3．糖及其缀合物分析
4．离子与大细胞分析
5．药物分析：药物成分分析；生物材料中药物及其代谢产物分析；手性分离
6．临床分析：由于代谢紊乱而引起的代谢产物分布异常时，多组分的同时检测
（三）在食品分析中的应用
42
1．食品本身成分
2．食品添加剂
3．食品污染物
（四）在石油化工产品分析中的应用：染料等。
第四节基因芯片
1．什么是基因芯片：
基因芯片指对数以千记的DNA片段同时进行处理分析的技术，诸如基因组DNA突变谱和
mRNA表达谱的检测等（Trends in Biotechnology）。基因是载有生物体遗传信息的基本单位，
存在于细胞的染色体上。将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体
上，称之为基因芯片。在一块1平方厘米大小的基因芯片上，根据需要可固定数以千计甚至
万计的基因片段，以此形成一个密集的基因方阵，实现对千万个基因的同步检测。
基因芯片是90年代中期发展起来的一项前沿生物技术，它融合了生命科学、化学、微电
子技术、计算机科学、统计学和生命信息学等多种学科的最新技术。要完成基因芯片的制备
直至获得检测结果，需要的设备包括点样仪、自动杂交系统、扫描仪和计算机工作站。
基因芯片的创意来自于计算机芯片。它和计算机芯片一样，具有超微化、高度集成、
信息贮存量大等特点，所不同的是，计算机芯片采用的是半导体集成电路，而基因芯片是以
基因片段作为“探针”进行工作。所谓“探针”，是利用碱基配对的原理检测基因的一种技
术。它就好比是用鱼杆钓鱼。以前的基因检测技术均只有一个“鱼钩”，一次只能钓到一条
鱼（即找到一种基因）。而基因芯片突出的优点是能在庞大的基因库中，一次发现众多的异
常基因，就好比在一根鱼杆上垂有成千上万个钓钩，可同时捕捉许多不同的鱼，从而实现快
速多样化检测。
2．芯片技术的主要特点
基因芯片就犹如一面超高倍率放大镜，映射出被测患者基因结构与正常人基因结构上的
细微差异，从而诊断出疾病。归纳起来，基因芯片技术具有高度并行性、多样性、微型化和
自动化这四大特点。高度并行性有利于基因芯片所示图谱的快速对照和阅读，效率大为提高；
多样性则提供了样品的多指标测定；微型化的好处在于对样品的需要量非常少，而且还能节
省试剂用量，降低成本；自动化使得人力投入减少并保证了质量。同时，它还具有操作简便、
信息综合处理能力强、结果可靠和仪器配套齐全等优势，因而备受青睐。
基因芯片的主要类型
鉴于信号的获取与解读具有通用性，所以此处不予特别介绍。从点阵的制备方法来分主
要有两类：原位合成型与“点膜”型。
原位合成型指根据预先设计的点阵序列在每个位点通过有机合成的方式直接聚合得到所要
求的探针分子。聚合之后芯片片基的制作即告结束。该方法有两类：光引导原位聚合技术与
压电打印原位聚合技术。
光引导原位聚合技术的简要过程为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起
来，选取择适当的蔽光膜（mask）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过
蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用
的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部
位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定
哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序
列寡聚体的目的。优点：合成效率高，点阵密度高缺点：设备昂贵，技术复杂，反应产
率低
3．基因芯片技术进展及应用
43
（1）基因表达检测
（2）突变检测如 BRCAⅠ基因外显子11]、CFTR基因、β-地中海贫血、酵母突变菌株、HIV-1
逆转录酶及蛋白酶基因等的突变检测等
（3）基因组多态性分析例如人类基因组单核苷酸多态性的鉴定及分型，人线粒体16.6kb
基因组多态性的研究等
（4）基因文库作图通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图
（5）杂交测序
（6） Etc.
基因芯片的体积虽小，但其工作效率之高，是任何传统的医学诊断方法所无法相比的。
例如，胰腺癌普遍有一种或多种包括 p16、p53和K-ras等在内的一种或多种癌基因和抑癌基
因结构异常改变，而假瘤性胰腺炎一般没有这些变化。用基因芯片诊断技术对患者进行一次
性采血化验，便可发现一些与癌相关基因有无突变或缺失，十分明确地将这两种疾病区分开
来。
除此之外，用基因芯片监测胎儿发育，有助于产前发现遗传性疾病；用其检测癌相关基
因，即可及时发现癌症；用其鉴定感染源，则能避免抗菌素的滥用。更为重要的是，基因芯
片诊断技术有着慧眼金睛般的洞察力，能发现那些貌似健康的人体内各种水平上蛛丝马迹的
变化。因此，这一技术的广泛开展能查出绝大多数处于萌牙期而无临床症状的疾病，从而使
它们得到及时而有效的防治。
随着人类基因组计划( Human Genome Project)即全部核苷酸测序的即将完成，人类基
因组研究的重心逐渐进入后基因组时代（ Postgenome Era）向基因的功能及基因的多样性
倾斜
［1，2］
。通过对个体在不同生长发育阶段或不同生理状态下大量基因表达的平行分析，
研究相应基因在生物体内的功能，阐明不同层次多基因协同作用的机理，进而在人类重大疾
病如癌症、心血管疾病的发病机理、诊断治疗、药物开发等方面的研究发挥巨大的作用。它
将大大推动人类结构基因组及功能基因组的各项基因组研究计划。
目前的应用范围主要包括基因表达和转录图谱分析及靶序列中单碱基多态位点（single
nucleotide polymorphism，SNP）或突变点的检测，表达型芯片的目的是在杂交实验中对多
个不同状态样品(不同组织或不同发育阶段、不同药物刺激)中数千基因的表达差异进行定量
检测，探针序列一般来自于已知基因的cDNA 或EST库，设计时序列的特异性应放在首要位置，
以保证与待测目的基因的特异结合，对于同一目的基因可设计多个序列不相重复的探针，使
最终的数据更为可靠。基因单碱基多态检测的芯片一般采用等长移位设计法［5］，即按靶序
列从头到尾依次取一定长度的互补的核苷酸序列形成一探针组合，这组探针是与靶序列完全
匹配的野生型探针，然后对于每一野生型探针，将其中间位置的某一碱基分别用其它三种碱
基替换，形成三种不同的单碱基变化的核苷酸探针，这种设计可以对某一段核酸序列所有可
能的SNPs位点进行扫描。
待分析样品的制备是基因芯片实验流程的一个重要环节, 靶基因在与芯片探针结合杂
交之前必需进行分离、扩增及标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而
有所差异。通常是在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。
对于检测细胞内mRNA表达水平的芯片，一般需要从细胞和组织中提取RNA，进行逆转录，并
加入偶联有标记物的dNTP，从而完成对靶基因的标记过程［11］，对于阵列密度较小的芯片
可以用同位素，所需仪器均为实验室常规使用设备，易于开展相关工作，但是在信号检测时，
一些杂交信号强的点阵容易产生光晕，干扰周围信号的分析。高密度芯片的分析一般采用荧
光素标记靶基因，通过适当内参的设置及对荧光信号强度的标化可对细胞内mRNA的表达进行
定量检测。近年来运用的多色荧光标记技术可更直观地比较不同来源样品的基因表达差异，
即把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记，并使它们同时与基因芯片杂交，通过
44
比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达基因的图谱，常用的双色荧光试
剂有Cy3- dNTP和Cy5- dNTP。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光技术可以大大提
高芯片的
第五节流式细胞术
流式细胞术
是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、
单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。是对处在快速直线流动状态中的细胞或生
物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的一门技术
其结构十分精密、复杂，但完全由计算机控制，使用亦十分方便。流式细胞仪一般由主
机、计算机及其应用软件和打印机组成。
流式细胞仪主要由光学系统、液流系统、和电子系统组成。三个系统密切配合，最终将
信号传入计算机（图 2）。细胞与荧光素标记的单克隆抗体（McAb）或与某些分子有特殊
亲和力的荧光染料结合后制成一定浓度的悬液并放入流式细胞仪的样本管中，细胞在气体的
压力下进入流动室。
流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列从流动室的喷嘴高速喷出成为细胞
液柱。细胞液柱与入射激光束垂直相交，相交点为测量区。通过测量区的细胞被激光照射后
产生光散射并发出荧光，光散射与荧光穿过滤光片，被光电倍增管（PMT）或光电二极管接
收并转变为电信号，这些信号经加工处理、储存于计算机中。
用专门的计算机软件对其储存数据进行图像显示、分析、统计运算，即可灵敏、准确、
特异地获得细胞的一系列重要的物理、生化及免疫学特征和功能状态等参数。仪器还可根据
预先设定的参数把指定的细胞亚群从整群中分选出来，供细胞培养、原位杂交、DNA 分析等
运用。
FACSCalibur 流式细胞仪的特点
　 1. 双激光
　 2. 四色荧光
　 3.自动化程度高、精确度高
　 4.分析速度快、准确性好
　 5.灵活的设计
　 6.细胞分选系统
细胞富集系统：当代最先进的细胞定量分析技术
45
流式细胞术的应用
● 细胞生物学
● 免疫学
● 遗传学
● 药理学
● 肿瘤学
● 血液学
● 病理学
● 临床检验
● 植物学
● 海洋生物学
肿瘤学中的应用
医学中应用最早的一个领域。用荧光染料(碘化吡啶;PI)染色后对细胞的 DNA 含量进行
分析，将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G1 期，S 期和 G2 期).
1.肿瘤 DNA 倍体的分析
2.细胞 DNA 周期分析
3.DNA 分析的临床意义
4.DNA 分析诊断肿瘤
DNA 非整倍体细胞峰
　突出的四倍体细胞峰
　 SPF>10-15%
• S 期比率与肿瘤组织学分级密切相关：
肺癌、乳腺癌、Hodgkin、卵巢癌、直肠癌、甲状腺癌、睾丸癌、脑型星形细胞瘤
DNA 倍体分析：
结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大
大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分
析，意义尤为重要。
增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性
• DNA 非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志
• 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息
• 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能
• DNA 指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标
• DNA 及倍体分析在某些肿瘤有预后价值：膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、皮肤
黑色素瘤
• 肿瘤细胞 DNA 倍体分析对病人预后的判断有重要作用，异倍体肿瘤恶性病变的复发率高、
转移率高、死亡率也高，而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好
根据化疗过程中肿瘤 DNA 分布直方图的变化去评估疗效，了解细胞动力学变化，对肿瘤
化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况，依据化疗药物对细胞
动力学的干扰理论，设计最佳的治疗方案。
Apoptosis（凋亡）：增殖和凋亡的平衡，决定肿瘤的生长速度。
1. 凋亡研究与疾病的关系
• HIV 感染，引起 CD4+细胞程序性死亡
46
• 程序性死亡异常，导致肿瘤发生
• 凋亡是自身免疫疾病的发病机制之一
2. 流式细胞术检测凋亡的研究内容
• Caspases 细胞酶的检测
• Annexin V 细胞膜磷脂酰丝氨酸检测
• DNA 碎片分析：Apo-BrdU
• 线粒体分析：JC-1
• 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2
多药耐药：是肿瘤病人化疗失败的主要原因，FCM 对多药耐药基因( P170 等)和凋亡抑制基
因及凋亡活化基因表达的测定，可为临床治疗效果分析提供有力依据。
细胞表面抗原分析：FCM 通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和
亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重
要作用。
T 细胞分化抗原测定
•临床意义
•CD4+T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如 AIDS、MCV、严重创伤、全身麻醉、
大手术、应用免疫抑制剂等；升高见于类风湿性关节炎活动期。
•CD8+ T 细胞下降常见于类风湿性关节炎、Sjogren 综合征、重症肌无力、DM（II 型）
以及膜型肾小球肾炎等；升高见于传染性单核细胞增多症急性期、MCV 以及慢性乙肝。
CD4 +/CD8+比值下降，常见于 AIDS、瘤型麻风病、恶性肿瘤进行期和复发时。也见于部
分感染性疾病如传染性单核细胞增多症、血吸虫病等；
增高见于类风湿性关节炎活动期、SLE、Sjogren 综合征、重症肌无力、膜型肾小球肾炎
以及器官移植后排斥反应等
B 淋巴细胞表面标志物检测
•B 细胞分化抗原 CD19、CD20、CD21、CD22 测定
•参考值：FACS：CD19+细胞 11.74%±3.73%
•临床意义 CD19 为全部 B 细胞共有的表面标志，增高见于 B 细胞系统的恶性种瘤，减低
见于体液免疫缺陷病。
NK 细胞活性测定
•临床意义
•活性升高常见于病毒感染的早期，Down 综合征，接受器官移植、骨髓移植的患者等及
免疫增强剂治疗患者。
•活性降低常见于恶性肿瘤、重症联合免疫缺陷病，AIDS 和免疫抑制剂治疗者等。
•肿瘤疗效观察及预后评价
•免疫调节功能 NK 细胞可释放 INF-γ、INF-β和 GM-CSF 等细胞因子。
血液病：FCM 通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和 DNA 的检测分析，对各种血液病的诊
断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。白血病的诊断和治疗：FCM 采用各种抗血细胞表
面分化抗原(CD)的单克隆抗体，借助于各种荧光染料(异硫氰基荧光素 FITC，藻红蛋白 PE
等)进行测定,获得多参数信息，正确地判断出细胞的属性。
47
干细胞表达 CD34，髓系表达 CD13、CD14，B 细胞系表达 CD10、CD19、CD20 等，T 细胞
系表达 CD2、CD3、CD5、CD7，利用 FCM 可以测定出血细胞表达各种抗原的水平，协助临床
确诊。
目前应用与临床的造血干细胞移植技术在对急性白血病和一些疑难性疾病治疗中,可应
用 FCM 技术]通过对人白细胞抗原(HLA)配型的测定,为异体干细胞移植病人选择出最合适的
供体。通过 FCM 测定 CD34、HLA-DR、CD33 等细胞表面标志物，已成为干细胞移植技术重要
的监测手段
阵发性睡眠性血红蛋白尿症是一种造血干细胞克隆病，细胞 CD55、CD59 抗原表达减低
是该病的一个特点。该抗原属于血细胞表面磷脂酰肌醇锚连蛋白家族，是重要的补体调节蛋
白，它通过与补体 C8、C9 的结合以阻止补体膜攻击复合物的形成，从而抑制细胞被补体激
活溶解。FCM 采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞 CD59 的表达做定量分析，可以协助临床
做出诊断并判断疾病的严重程度。
网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标，FCM 通过某些荧光染料(吖啶橙、噻
唑橙等)与红细胞中 RNA 结合，定量测定网织红细胞中 RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞
的百分比。FCM 还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义。为
干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤病人放化疗对骨髓的抑制状况等提供依
据。
在血栓与出血性疾病中的应用
血小板功能的测定：正常情况下血小板以分散状态在血管内运行，但当血管损伤、血流
改变或受到化学物质刺激时血小板被活化而发生一系列改变。
FCM 测定血小板膜糖蛋白的表达情况成为检查血小板功能的一种新手段。该方法灵敏、
特异性高，如果采用全血法测定，只需微量标本，适合于儿童及血小板减少性疾病的患者。
血小板活化
使用流式细胞仪，同时分析血小板多个活化指标，灵敏、特异地检测全血中的血小板，
了解血小板的反应性和活化进程
ƒ 血小板表面膜糖蛋白�*****P）：PAC-1
ƒ 颗粒膜 GP 的表达量变化：CD62P
ƒ 直接使用全血，样本更接近生理状况
ƒ 操作步骤简便、用血量少、避免体外活化与血小板亚群丢失
ƒ 血小板减少患者也能精确分析
临床意义
¾ 直接测量循环血小板活化状态与反应性
¾ 可测定凝血酶等诱导剂活化的血小板，即通过血小板体外活化，评估病人血小板的活化
能力
¾ 血小板活化与临床的关系：监测血小板活化相关疾病过程，抗血小板药物疗效或治疗药
物的影响，预测血栓形成　心肌缺血（心绞痛、心肌梗塞）与血小板活化有关
¾ 预测冠状动脉成形术后发生急性缺血事件的危险性
¾ 缺血性脑血管病与血小板活化有关
¾ 子痫前期、外周血管疾病等均有血小板活力增加
¾ 抗血小板治疗疗效监测
¾ 同时分析血小板的多种表面标志
¾ 流式细胞仪分析，高度灵敏
¾ 使用全血分析，标本用量少
¾ 操作简便快捷，将血小板人工激活减至最低
48
血小板相关抗体的测定：免疫性血小板减少性紫癜病人血浆中可产生血小板自身抗体，结合
在血小板表面，称为血小板相关抗体，其分子可以是 IgG、IgA 或 IgM，用羊抗人 IgG 、IgA、
IgM 荧光抗体标记被测血小板，FCM 可以测定血小板相关抗体含量。直接法检测血小板表面
的相关抗体，间接法可测定血清中的相关抗体。该方法用于该病的诊断及治疗监测，具有检
测速度快、灵敏度高的优点。
T 淋巴细胞亚群测定(生理或病理)：Ｔ淋巴细胞各亚群之间相互制约、相互协助，处于平衡，
一旦哪一方增多或减少都影响另一方，形成失调，导致各种免疫损伤和疾病。
妊娠高血压综合征（prognany induced hypertension syndrome,PIH）孕期特有而
又常见的产科疾病。CD3 代表总 T 淋巴细胞，有二个主要亚群：即辅助性 T 细胞和抑制性 T
细胞。CD4 代表辅助性 T 细胞亚群，其主要功能为调节免疫反应的活性，通过其分泌的淋巴
因子，增强和扩大免疫应答过程，辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性 T 细胞，B 细胞来共同发
挥免疫作用；CD8 代表抑制性 T 细胞亚群，它能抑制 B 淋巴细胞产生抗体，抑制细胞毒性Ｔ
细胞的杀伤功能。
妊高症与正常妊娠相比 CD8+及 CD4+/CD8+无明显差异，CD3+、CD4+有显著性差异，提示
妊高症免疫失调可能与 T 辅助细胞亚群增加密切相关。
T 辅助细胞又可分为三种亚类：即促进细胞免疫的 Th1 细胞、促进体液免疫的 Th2 细胞。
Th1 和 Th2 在妊娠期母胎间细胞因子网络平衡的调控中起重要作用，Th1：Th2 的比例与妊高
症存在重要联系。因此，从免疫学方面分析 PIH 病因，探索治疗方案将是一个重要的突破
口。何种因素直接导致 PIH 尚无定论。分析淋巴细胞，特别是 T 辅助性细胞亚群的比例是一
个研究方向。
在强直性脊柱炎中的应用：强直性脊柱炎（ANKY LOSING SPONDY LITIS，AS）是目前已知与
HLA 有强关联的一种疾病。
HLA-B27 试剂盒与 HLA-B27 自动软件配套使用，为我们提供了一种快速、准确的检测病
人 T 淋巴细胞表面的 HLA-B27 抗原表达的方法。与传统方法相比，用流式细胞仪检测
HLA—B27 的表达，无须分离淋巴细胞，操作简单，自动化程度高；灵敏度可达 100%，特异
性达 97.4%；结果稳定，不同仪器之间，不同实验之间可比性高。
•
49
50

评价一下你浏览此帖子的感受

分享到： QQ空间新浪微博腾讯微博人人网网易微博

回复引用

举报顶端

上一主题下一主题

考博论坛 » 考博见面礼

http://www.freekaobo.com
访问内容超出本站范围，不能确定是否安全
继续访问	取消访问

快速回复
	限 100 字节进入高级模式加粗字体颜色背景颜色插入链接图片验证问题: 免费考博论坛网址是什么? 正确答案:freekaobo.com 按"Ctrl+Enter"直接提交	上一个下一个