第五讲 分子生物学研究法
H)a
C'M^ 一、 重组DNA技术发展史上的重大事件
`1<3Hu_ 1.40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；
z2V 8NUn 2.50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；
k]9> V@C 3.50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
@b\_ 696. 年份 事 件
7d8qs%nA 1869 F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。
SJ7=<y}[d 1944 O.T. Avery证实DNA是遗传物质。
[Ms{J!^q 1952 A.D. Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。
I jztj 1953 J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。
A""*vqA 1957 A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
U]EuDNkO{ 1958 M. Meselson和F. W. Stahl提出了DNA的半保留复制模型。
UA4d|^ ev 1959-1960 S. Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。
]l7\Zq 1961 Nirenberg破译了第一相遗传密码；F. Jacob和J. Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。
- JhjTA 1964 C. Yanofsky和S. Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。
7 +hF; 1965 S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
y{I[ }$k 1966 M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。
[P c[{( 1970 H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
b<V./rWIB 1972-1973 H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆。
lF"(|n"R 1975-1977 F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。
J}_Dpb [L 1978 首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
6 %k
+0\d 1980 美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。
bKJ7vXC05 1981 R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP: Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’" bbioo.com>转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP: Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’" bbioo.com>转基因果蝇。
#iU8hUbo 1982 美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
jo3}]KC ! 1983 获得第一例<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP: Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%D7%AA%BB%F9%D2%F2&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’" bbioo.com>转基因植物。
KP d C9H 1984 斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。
5h=TV 1986 GMO首次在环境中释放。
3?Eoj95w! 1988 J. D. Watson出任"人类基因组计划"首席科学家。
$#ju? B~ 1989 DuPont公司获得转肿瘤基因小氧--"Oncomouse"。
V]kGcS} 1992 欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定(315kb)
._MAHBx+G 1994 第一批基因工程西红柿在美国上市。
ssyd8LC# 1996 完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。
&< |-> *v 1997 英国爱丁堡罗斯林研究所获得<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆羊。
O][Nl^dl 基因工程中常见的名词:
oBNX8%5w 遗传工程--genetic engineering，基因操作--gone manipulation，基因<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆--gone cloning，
:{ WrS 重组DNA技术--recombinant DNA technology，分子<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆--molecular cloning。
'Ywpdzz[ 基因工程的主要内容或步骤:
#DK3p0d 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。
e_~ fJ 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。
"`i:)
E t 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。
d1TdH s\ 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。
~l*?D7[o 5. 将目的基因<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。
MYw8wwX0kJ Ph#F<e(9 二、 基因操作的主要技术原理
p ba8=Z 1． 核酸的凝胶电泳(Agarose & Polyacrylamide)
<ql w+RVt 将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比（分子大小、极性、介质的粘度系数等）。
$ ~,}yh; 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以，DNA和RNA实际上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极→正极移动。
Q-8'?S 在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭（EB）--ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。
`kNi*I^ DNA的脉冲电泳技术 :PFGE-Pulse-field gel electrophoresis
{ 8f+h 2． 核酸的分子杂交技术
"<w2v'6S 在大多数核酸杂交反应中，经过凝胶电泳 分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，通过毛细管作用或电导作用按其在凝胶中的位置原封不动地"吸印" 转移到滤膜上的。常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸（DBM）和二乙氨基乙基纤维素滤膜（DEAE）等。
`/w\2n 核酸分子杂交实验包括如下两个步骤：
V'"I9R'1 将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程特称为核酸印迹(nucleic acid blotting)转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法(dot and slot blotting)、菌落和噬菌斑印迹法(colony and plaque blotting)；
'cAc{\) 将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。所以有时也称这类核酸杂交为印迹杂交。
J}(6>iuQY? 3． 细菌的转化
cZgMA8
F 所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。这种提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做受体菌株。大肠杆菌是最广泛使用的实验菌株。在加入转化DNA之前，必须预先用CaCl2处理大肠杆菌细胞，使之呈感受态（Competent Cells）。Mg2+对维持外源DNA的稳定性起重要作用，质粒DNA中的抗生素是筛选标记。
AU xM)H 对绝大多数hsdR-，hsdM-突变体菌株（k12），每ug DNA可得107-108个转化子。
wMz-U- z 4． DNA序列分析
iIsE
Q h a. Sanger的双脱氧链终止法
ZM oJ#p( Cambridge的F. Sanger在1977年发明用双脱氧链终止法测定单链DNA的序列，其基本原理如下：
o e!:|ck< ①DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准确的DNA互补链；②该酶能够用2’，3’--双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合到新生寡核苷酸链的3’-末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加入模板DNA，引物（特异性引物，如T7，T3，M13等），DNA聚合酶，dA，dT，dG，dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5’→3’外切酶活性。
;NH~9# t: b． Maxam-Gilbert化学修饰法(哈佛大学)
bR`r T4.F 该方法的基本原理是用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。
(S
k#x 该反应的关键在于使DNA的4种核苷酸中，只有1-2种发生特异性的化学切割反应：
,{ ?q^" 碱基的特异性修饰；
F<Hqo>G 被修饰的碱基从核糖环上转移；
L6:W'u^ 失去碱基的糖环部位发生DNA链断裂。
i s L{9^ 专门用来对核苷酸作化学修饰，并打断磷酸二酯键的化学试剂有硫酸二甲酯(dimethylsulphate)和肼(hydrazine)。
iW|s|1mh3 硫酸二甲酯是碱性化学试剂，能使DNA链中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N6位发生甲基化，在中性PH环境中就能使糖苷键发生水解，并引起DNA链的断裂。在碱性条件下，肼能特异性切割C和T。如果加入1 mol/L的Nacl，那么，只有C被特异性切割。
{J~(#i
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c． DNA序列分析自动化
&:V@2_6" 用四甲基若丹明(Tetramethylrhodamine)作为荧光剂标记DNA引物，带有这种引物的DNA片段能在激光诱导下发出荧光。按照标准的双脱氧终止法或化学终止法进行测序反应，跑DNA凝胶后用计算机检测。
a`H\- G d.DNA杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)
FXx.$ W 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有5种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。
PSTu /^ 当靶DNA与标记探针形成G-T或G-A末端碱基错配的双链体时，检测有一定难度。寡核苷酸探针越短，碱基错配造成的去稳定效应越明显，较易与完全的双链体分子相区分。但是，探针短，杂交产物的总体稳定性下降，信/噪比下降，影响结果的可靠性。所以，6-mer寡核苷酸矩阵芯片只能用于测定500bp的靶DNA；7-mer=2000bp，8-mer=8000bp。
-@''[m .* SBH的应用：
Z-)[1+Hs ① 可有效检测靶DNA中的单碱基突变；
oi2J :Y4 ② 可用于不同DNA片段之间的序列比较；
Y4mC _4EU ③ 可用于检测不同生长发育状态下细胞中特定基因的表达状况；
F =XF] ④ 可用于检验传统测序技术的准确性。
R?
O- x9 )YuRjBcp," 5． 基因的定点诱变（site-directed mutagenesis）
C"6 Amnj 使已<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。
wms 1IV%; a. 盒式诱变(cassette mutagenesis)，包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。
Lf
>YdD b．寡核苷酸引物诱变
YgCc|W3{ 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物，进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分。
]}Pl%. C．PCRG与PCR诱变
VS?dvZ1cC vXephR' 6． 利用DNA与蛋白质的相互作用进行核酸研究.
Fse['O
~ a.凝胶滞缓实验(Gel retardation assay)，又称DNA迁移率变化试验(DNA mobility shift assay--EMSA)。
,Ij=b b． DNase I 印迹试验（DNase I foot printing）
+p3 Z#KoC 主要步骤：
<}d/v_+pnh ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端；
TMK'(6 dH ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育；
=f>HiF ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使DNA链发生断裂。
Rho5s@N 7 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键，要保证一条链只发生一次断裂！
`)6>nPr7P ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）；
Z |
We9% ⑤进行DNA凝胶分析。
L[rpb.'FG 如果某个蛋白质已经与DNA的特定区段相结合，那么，它就会保证该区段DNA免受消化或降解作用。在电泳凝胶的放射自显影图片上，相应于蛋白质结合的部位不产生放射性标记的条带。
j ") FaIM c． 甲基化干扰试验(Methylation interference assay)
U
IfH*6X 用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。
Qm<
g b+ d． 体内足迹试验
g Qy~kctQ# 用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA链上的蛋白质结合区。
]u+M TW; / }=a{J 三、分子<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆技术
Ox^:)i i
1、高质量mRNA的制备
V$(/0mQV( 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。
~b Rd)1 2． 反转录成cDNA
vf<UBa;Xm 可同时在反转录系统中加入Oligo（dT）12-18-mer及随机引物R6，以保证得到全长cDNA；
{ b1UX9y 应选用活性较高的反转录酶（Reverse transcriptase）；
F I8k;4|V 应选用甲基化dCTP；
3y ryeS 应保证所获得双链cDNA的方向性。
' sey D Super Script Choice cDNA合成系统中所用的poly（dT）引物
DR@1z9 a 因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5’-methyl C的外源DNA，所以，应选用mcrA- mcrB-菌株。
!2$ z *C2; 3．分子<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆的主要方法
e0 u,zg+m （1）构建cDNA、核DNA文库，应用现有核酸探针分离新的目的基因；
'a#mViPTQ) （2）差式杂交(differential screen)和扣除杂交(subtractive hybridization)技术；
V@ % （3）DD-RT-PCR法及差别显示技术；
i.y=8GxY （4）差别分析法 (RDA法，即Representational difference analysis）；
B_ k2u （5）酵母双杂交体系Two-hybrid system；
b}@(m$W （6）图位<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆法（map-based cloning）与染色体步移 �*****enomic DNA Walking）。
B76 v}O: 习惯上，人们用<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆表示由同一物种具有相同基因型的两个或多个个体组成的群体。所以，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（monozygotic twins）便属于同一<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆。细胞学上，<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆是指由同一个祖细胞（progenitor cell）分裂而来的具有同一遗传背景的子细胞群体。分子生物学上，把将外源DNA插入具有自主复制能力的载体DNA中，使之得以自主复制和永久保存的过程叫做分子<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆。
_y v Lu j 文库筛选与基因丰度有关。高丰度基因，如蚕丝心蛋白，卵清蛋白等在某些特定组织中可占细胞总mRNA量的50-90%，非常容易被分离。低丰度基因，一般在细胞中只有10-20个拷贝，哺乳动物细胞中可含10,000到40,000种不同的mRNA，如果要达到99%的期望值，大约需要筛选150,000-170,000个<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆子。一般情况下，每微克cDNA可产生10万-60万个<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆子。
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A.差式杂交或扣除杂交<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆技术
R^%e1 KO] B.cRNA差式显示法
/syVGmS'M 除了极少数特例(如组蛋白基因)之外，几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一段多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。
:$g8Zm,y P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3’-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5’-T11MN或5’-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。
!8R@@,_v DDRT-PCR的主要步骤：
Dx-KMiQ,"( Ⅰ.从不同发育阶段或不同基因型的细胞群体中分离mRNA，并以3’锚定引物作为反转录的引物，合成第一键cDNA；
U>P|X=) Ⅱ.用5’随机引物和某个3’端锚定引物对扩增第一链(掺入32p-dNTP)；
UXH" si: Ⅲ.用DNA变性测序胶分离扩增产物，X光片曝光后检测差别条带；
!tXZ%BP. u Ⅳ.回收特异性差别条带；
uP
@\#/4u Ⅴ.用同一引物对扩增已回收的DNA条带；
_w(ln9 Ⅵ.用Northern，Southern及测序法分析所得的条带；
0 [8=c&F Ⅶ.以该DNA片段做探针，筛选全长cDNA或核基因。
1ibnx2^YB C.cDNA差式分析法(Representational ditterence analysis)
{v` 2sB RDA法充分发挥了PCR以指数形式扩增双链DNA模板的特性，通过降低cDNA群体复杂性和更换cDNA两端接头等方法，特异扩增了目的基因片段。因为试验对象（Tester）和供试探针（Driver）在接受差式分析前均经一个4碱基切割酶处理，形成平均长度256bp的代表群（representation）保证绝大部分遗传信息能被扩增。每次T减D反应后仅设置72℃复性与延伸，94℃复性这两个参数共20个PCR循环，PCR产物的特异性和所得探针的纯度非常高。
>MG(qi D.酵母双杂交体系
s-*._; Two-hybrid system也叫interaction trap（相互作用陷井），是90年代初发展起来的分离基因的新方法，可用于分离能与已知靶蛋白质（target protein）相互作用的基因。
6X)@ajGWg~ 基本原理：
.Cz %:%9 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、功能上独立的结构域组成的。如GAL4的N端1-147aa是DNA结合域（BD），其C端768-881aa是转录激活域（AD）。一般情况下，AD能与GAL4效应基因启动子上游的特定DNA区段（UAS）相结合，而此时，AD则推动了转录起始。
6CCbBA 若用基因工程的方法，将GAL4 AD和BD分别<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆到不同的载体上，导入同一细胞株中表达，效应基因无法被激活,但可把来自不同转录因子的AD或BD区域连成一个功能基因。
nfdq y) 主要实验过程：
> cN~U3 a. 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株-SFY526或HF7c；
"i&"* ~ b. 构建带有GAL1 UAS-启动子-lac Z（His3）的转化载体;
"D][e' c. 把已知的靶蛋白质编码基因<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆到pGBT9的多<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆位点上，把所有cDNA都<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆到pGAD424载体上，构成cDNA表达文库。
bAwl:l\` d. 从大肠杆菌中分别提取这两种重组质粒DNA，共转化感受态酿酒酵母菌株。
cz/Q/%j$/ e. 将共转化的酵母菌株涂布于缺少Leu，Trp和His的培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白的阳性菌落。
H '= (` E.基因的图位<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆法
0;.<~;@h Map-based cloning是分离未知性状目的基因的一种好方法。从理论上说，所有具有某种表现型的基因都可以通过该方法<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆得到。首先，将目的基因定位到某个染色体的特定位点，并在其两侧确定紧密连锁的RFLP或RAPD分子标记。二、利用与目的基因最紧密连锁的一对分子标记作探针，通过染色体步移技术将位于这两个标记之间的基因片段<A&NBSP;CLASS=’CHANNEL_KEYLINK’&NBSP;HREF=’HTTP:
www.bbioo.com Article Search.asp?Field="Title&ClassID=&keyword=%BF%CB%C2%A1&Submit=+%CB%D1%CB%F7+’">克隆并分离出来。三、根据基因功能互作原理鉴定目的基因。
g(ogXA1 通过对许多不同的生态型及大量限制性内切酶和杂交探针的分析，找出与目的基因距离最近的RFLP标记。在RFLP作图中，连锁距离是根据重组率来计算的，1cm（厘米）相当于1%的重组率。人类基因组中，1cm≈1000kb;拟南芥菜中，1cm≈290kb;小麦中， 1cm≈3500kb。
o "z@&G" ^ # 1.YKo 四、 DNA的Microarray
n_u1&a' 只要事先除去高度及中等重复序列，任何DNA都可以被用于Microarray。最简单的例子是用机械手把极微量（nanoliters）的DNA点到玻片或其它载体上，照射UV light使之永久固定，用不同细胞周期发育阶段的cDNA作探针系统性地研究细胞中任意时期特异表达的基因；若把某一生物体内全部全部已知基因分别点到DNA微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的cDNA与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性；基因芯片还可用于进行基因诊断，可建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图。用可疑病人的cDNA做探针与之杂交，检查哪些基因的表达受抑制或激活。
0N :XIGFa '%saL >0 n_ nl{ :dI\z]Y( 58tVx' 1y
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^:=f^N=^ {aY Y85j *^%*o?M~ 第六讲 原核基因表达调控
2&!bfq![ 原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应毫无保障，只有能根据环境条件的改变合成各种不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。自然选择倾向于保留高效率的生命过程。在一个每30min增殖一倍的109细菌群体中，若有一个细菌变成了29.5min增殖一倍，大约经过80天的连续生长后，这个群体中的99.9%都将具有29.5min增殖一倍的生长速度。
R& f^+0%f Cq)IayD@ 一个大肠杆菌细胞中约有2500-3000个基因。估计正常情况下，可带有107个蛋白质，平均每个基因产生3000多个蛋白质分子。但大肠杆菌中一般带有15,000-30,000个核糖体，有50余种核糖体结合蛋白，数量也很惊人。此外，负责糖酵解系统的蛋白质数量也很大。而象半乳糖苷酶等诱导酶，其含量可少至每细胞仅1-5个分子。
_+l1 b"^s1 6uPcXd:8ZR 一个体系在需要时被打开，不需要时被关闭。这种"开-关"（on-off）活性是通过调节转录来建立的，也就是说mRNA的合成是可以被调节的。当我们说一个系统处于"off"状态时，也有本底水平的基因表达，常常是每世代每个细胞只合成1或2个mRNA分子。所谓"关"实际的意思是基因表达量特别低，很难甚至无法检测。
}J:+{4Yn Z;l`YK^- 科学家把这个从DNA到蛋白质的过程称为基因表达(gene expression)，对这个过程的调节就称为基因表达调控(gene regulation或gene control)。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念，掌握了基因表达调控的秘密，我们手中就有了一把揭示生物学奥妙的金钥匙。
8;14Q7,S RDqFL .-S 基因表达调控主要表现在以下几个方面：
7nq 3S ① 转录水平上的调控(transcriptional regulation)；
M=qb^~ l ② mRNA加工成熟水平上的调控(differen, tial processing of RNA transcript)；
}Z-Z| G)# ③ 翻译水平上的调控(differential translation of mRNA).
X1{[}! %V9ZyQg%* 原核生物中，营养状况(nutritionalstatus)和环境因素(environmental factor)对基因表达起着举足轻重的影响。在真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平(hormone level)和发育阶段(developmental stage)是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。
l:#-d.z# u c7Eq45 一、 乳糖操纵子的调控模式
XW{>-PBg: 大肠杆菌乳糖操纵子(lactose operon)包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、控制子和阻遏子等。转录时，RNA聚合酶首先与启动区(promoter,P)结合，通过操纵区(operator,O)向右转录。转录从O区的中间开始，按Z→Y→A方向进行，每次转录出来的一条mRNA上都带有这3个基因。转录的调控是启动区和操纵区进行的。
66x?A0P \s"U{N- Z编码β-半乳糖苷酶；Y编码β-半乳糖苷透过酶；A编码β-半乳糖苷乙酰基转移酶。β-半乳糖苷酶是一种β-半乳糖苷键的专一性酶，除能将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，还能水解其他β-半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）。β-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的β-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。β-半乳糖苷乙酰基转移酶的作用是把乙酰辅酶A上的乙酰基转到β-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。
F!zP<A " =@2FX&&E_ 1． 酶的诱导-lac体系受调控的证据
2*"Fu:a"`I 在不含乳糖及β-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型每个大肠杆功细胞内大约只有1-2个酶分子。如果在培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。
0:0NXVYs& qyC=(v 科学家把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸但没有任何半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代，然后再将这些带有放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中，随着培养基中诱导物的加入，β-半乳糖苷酶便开始合成。分离β-半乳糖苷酶，发现这种酶无35S标记。说明酶的合成不是由前体转化而来的，而是加入诱导物后新合成的。
6 DG @?O O,aS`u & 已经分离在有诱导物或没有诱导物的情况下都能产生lacmRNA的突变体，这种失去调节能力的突变体称为永久型突变体，为分两类：I型和O型。
I&n \`V;z~@iA I型：野生型为I+，突变型为I-
cdqB,]" O型：野生型为O+，突变型为Oc。
2(5ebe[ }_=eT] I+→I-或O+→Oc后，Z、Y、A结构基因均表现为永久表达，所以I基因被称为调节基因(regulatory gene)。研究发现，I基因是一个产生阻遏物的调节基因，其产物使体系关闭。I-突变体由于不能产生阻遏物，使细胞成为lac永久表达型。I-/I+局部二倍体由于带有一个正常阻遏物，使细胞中的lac仍然被抑制。
WJ<^E"^ Bqma\1cgb 遗传学图谱分析指出，Oc突变位于I与Z之间，所以，lac体系的4个基因的序列为IOZY。通过这些观察，Jacob和Monod推断Oc突变代表DNA链上的一个位点或一个非编码区域，而不是一个基因，因为可编码的基因具有互补性，而Oc没有这一特性。O决定相邻Z基因的产物是诱导型合成还是永久型合成，O区域称为操纵基因。
-*5Rnx|Y{ bR@p<;G| 2. 操纵子模型
Z{&cuo.@<] Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）现象是个基因调控问题，可以用实验方法进行研究，因此选为突破口，终于通过大量实验, 及分析，建立了该操纵子的控制模型。
X7k.zlH7T 6aM*:>C" ① Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子的mRNA分子所编码。
*m?/O} R ② 这个mRNA分子的启动子紧接着O区，而位于I与O之间的启动子区（P），不能单独起动合成β-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。
lHgs;> U$ ③ 操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物的结合位点。
=zQN[ ④当阻遏物与操纵基因结合时，lacmRNA的转录起始受到抑制。
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O$ %-70 ⑤诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lacmRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。
;a:[8 Yi 2UG sYQn 3. Lac操纵子的本底水平表达
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5?F 因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而运转诱导物需要透过酶。在非诱导状态下有少量（1-5个mRNA分子）lac mRNA合成--本底水平永久型合成。
mI 74x3 [ pz"0J_xDM 4. 葡萄糖对lac操纵子的影响--代谢物阻遏效应
p/+a=Yo 研究表明，葡萄糖对lac操纵子表达的抑制作用是间接的，因为存在一种大肠杆菌突变株，它正常的糖酵解过程受阻，葡萄糖-6-磷酸不能转化为下一步代谢中间物，该菌株能在有葡萄糖存在的情况下被诱导合成lac mRNA。
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[cpRe \rv<$d@ L 5. cAMP与代谢物激活蛋白
!47n[Z s 当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时，lac启动子表达受阻，没有β-半乳糖苷酶活性；当葡萄糖消耗完以后（图中箭头处），细胞内cAMP浓度增加，β-半乳糖苷酶活性被诱导，一度停止生长的细胞又恢复分裂。如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中，细胞内cAMP浓度就很高；若在含葡萄糖的培养基中培养，细菌中的cAMP浓度就会很低；如果将细菌置于甘油或乳糖等不进行糖酵解的碳源培养基中，细菌中cAMP的浓度也会很高。
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7 / m=HG^! 研究证实，葡萄糖所引起的代谢物抑制(Catabolite repression)现象的实质是该代谢物降低了细胞中cAMP的含量.事实上，cAMP-CAP复合物是lac体系的positive regulator，它们不能代替lacI和lacO的功能(negative regulator)。
21"1NJzP 5oAK8I cAMP-CAP不但能与DNA相结合，造成双螺旋弯曲，易于形成三元转录起始复合物，它还能直接影响RNA聚合酶的活性。Dominant negative（Trans-dominant）lacI-d，只要有这个"环"的亚基存在，lacI+基因产物（阻遏物）无法与O区相结合lac operon得到表达。
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\wg 6. lac操纵子DNA的调控区域--P.O.区
d3xmtG {i lac P（启动子区）从I基因结束到mRNA转录起始位点止，共长82bp（-82～+1）O区就是阻遏物结合区，位于P区后半部分和转录起始区（-7～+28），该区序列有对称性，其对称中心点在+11位。P区的CAMP-CAP结合区（-67～-52）也有对称性，其对称位点在-60～-59之间。
;+ "+3 %7|9sQ: 在一个完全被诱导的细胞中，β-半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为1:0.5:0.2，这个比例在一定程度上反映了以β-半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要。不同的酶在数量上的差异是由于在翻译水平上受到调节所致。
s0vDHkf8 WlU0:(d ①lac mRNA可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译。这种现象发生的频率取决于每一个后续的AUG密码子再度起始翻译的概率。
Zu7)gf ②在lac mRNA分子内部，A基因比Z基因?
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