主题 : 浙江大学2008

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lyj2000

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楼主发表于: 2008-11-26

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浙江大学2008

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP）限制性片段长度多态性，当用限制性内切酶切割不同品种或个体的基因组DNA时，如果限制性内切酶的酶切位点的碱基发生突变，或者酶切位点之间DNA片段发生碱基的插入或缺失，导致酶切片断的大小、数量发生了变化，产生相当多的数目和大小不等的DNA片段。这种变化可以通过特定的探针杂交进行检测，从而可以比较不同品种或个体之间的DNA水平的差异（或多态性）。广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物的进化和分类关系研究。

RAPD（Random Amplified Polymorphism DNA, RAPD）随机扩增多态性DNA，利用随即引物扩增寻找多态性DNA片段的分子标记方法。是建立在PCR技术基础上，利用一系列（通常数百）不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链（一般为10 bp）为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，然后用凝胶电泳分开扩增片段，EB等染色剂染色后检测扩增产物DNA片段的多态性。与RAPD技术相类似的还有AP-PCR（Arbitrary Primed PCR）和DAF（DNA Amplified Fingerprints）2种标记技术。在AP-PCR分析中，所使用的引物较长（通常10～50 bp），扩增分为3个部分，每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异。DAF是一种改进的RAPD分析技术，与RAPD技术不同的是它使用引物浓度更高，长度更短（一般5～8 bp），只有2个温度循环，并常用聚丙烯酰胺凝胶电泳，所提供谱带信息比RAPD大得多。

AFLP（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）扩增片段长度多态性，AFLP是RFLP和PCR结合的产物，其基本原理是：将基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增，使用双链人工"接头"与基因组DNA的酶切片段相连接作为扩增反应模板，"接头"与"接头"相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。这样就只有那些两端序列能与选择碱基配对的限制性片段被扩增，再在高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物。该技术的独特之处在于所用的专用引物可在不知道DNA信息的前提下就可对酶切片段进行PCR扩增。是目前一种十分理想有效的分子标记

STS（Sequence-Tagged Site, STS）序列标签位点是基因组上定位明确、作为界标并能通过PCR扩增被唯一操作的短的、单拷贝DNA 序列，，用于产生作图位点，即测定一系列STS 的次序即可作出基因组区域的图谱。STS主要包括简单重复序列（Simple Sequence Repeat Polymorphisms, 简称SSR或SSRP）、锚定简单重复序列（ Anchored Simple Sequence Repeats, ASSR）、序列特异扩增区域（Sequence-characterized amplified regions）、酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphism Sequences, CAPS）、单引物扩增反应（Single Primer Amplification Reaction, SPAR）等标记技术。

SSR (Simple　Sequence　Repeats，SSR) 简单重复序列真核生物的基因组中散布大量的串联重复序列，其中2～4个bp的微卫星序列具有高度多态性，微卫星在结构上的最大特点是两端序列较保守，因此可设计与两端保守序列互补的引物进行PCE扩增，来揭示微卫星的多态性。SSR 是检测多态性的一种有效方法。

SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP）单链构像多态性是指相同长度的单链DNA因核苷酸序列的差异，甚至单个碱基不同，而产生的构像变异，在非变性聚丙烯酰胺中表现为电泳迁移率的差别。PCR产物变性处理，双链DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。SSCP结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的DNA特异性，达到指纹分析的目的。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

SNP（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）单核苷酸多态性是指DNA序列上单个核苷酸的差异，是单个核苷酸置换产生的遗传标记。根据从STS中确定SNP位点的经验，每千个核苷酸会出现一个标记位点，因SNP的分布密集。检测SNP的最佳方法是DNA芯片技术，如果能将所有SNP全部信息载入DNA芯片，就可制造基因组扫描仪，用来扫描各个个体并分析它们在基因组成上的差异。

SCAR(Sequence-characterized amplified regions) SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。目标RAPD片段克隆和测序，根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物进行PCR特异扩增。

EST（expressed sequence tag，EST）表达序列标签短的、单次（测序）阅读的cDNA 5’或3‘端序列。也包括来自于差异显示和RACE实验的cDNA序列。一般是来自不同组织来源的cDNA序列，长度在300-500bp左右。

Contig 重叠群或邻接片段基因组测序中将许多序列片段经过比对找到重叠区，从而连接成长片段，这些片断称重叠连续群，简称重叠群。

UniGene — 被整理成簇的EST和全长mRNA序列，每一个代表一种特定已知的或假设的人类基因，有定位图和表达信息以及同其它资源的交叉参考。

SAGE（serial analysis of gene expression,），基因表达系列分析是近几年来发展起来的一种快速分析基因表达水平信息的技术。它通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表达丰度不同的SAGE标签序列，从而接近完整地获得基因组的表达信息。

基因组学�*****enomics），指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录本图谱），核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一门科学。基因组研究应该包括两方面的内容：以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为目标的功能基因组学，又被称为后基因组（postgenome）研究。

蛋白质组（proteome）指全部基因表达的全部蛋白质及其存在方式，是一个基因、一个细胞或组织所表达的全部蛋白质成分，蛋白质组学是不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。

蛋白质组学（protemics）。蛋白质组学是不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体的研究。它从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式，功能机理、调节控制、药物开发、新陈代谢途径等提供理论依据和基础。

功能基因组学（Functuional　genomics）又称为后基因组学（Postgenomics），它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质得研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。

RNAi 和反义RNA
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制。 RNAi的机制可能是双链RNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下，被切割成21-23 bp大小的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC可以精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。
双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。
反义RNA (antisense RNA) 是一种本身缺乏编码能力,但能与特异靶RNA(主要是mRNA) 互补的RNA 分子,它可通过配对碱基间氢键作用与靶RNA 的特定互补区域结合形成双链复合物,抑制靶RNA 的功能,从而调控基因的正常表达。反义RNA 技术的基本原理是利用自然存在的或人工合成的反义RNA,通过基因重组技术反向插入到合适的表达载体形成重组DNA ,然后转染受体细胞,则这一反向插入的序列就会随细胞周期产生大量反义RNA ,对基因的表达进行调控,从而抑制、封闭或破坏靶基因的表达。选择具有明显的生物学效应的靶序列后,反义RNA 即通过和相应的RNA 互补而达到阻断其功能的目的。

YAC（yeast artificial chromosome，YAC）
一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必需的端粒、着丝点和复制起始序列。
BAC (Bacterial Artifical Chromosome，BAC)
BAC系统是基于大肠杆菌中可大容量容纳基因且稳定性良好的F因子衍生而来的载体系统，可容纳超过100kb的插入片段，BAC克隆的插入片段的平均长度为120kb，最大可达到240kb左右。良好的稳定性和操作的简便性是BAC系统的主要优点。

PAC（P1 bacteriophage artificial cromosome，PAC）
PAC系统是以噬菌体P1为基础的克隆系统，它可容纳70～100kb的插入片段，并可选择性地区分重组子和非重组子，且同时有两套复制机制。单拷贝复制子可用于稳定克隆增殖，而多拷贝复制子则可在Lac操纵子的控制下用于DNA的制备。

CAP 分解代谢活化蛋白，是原核E. coli细胞内作用最强的基因调节物之一，是控制营养代谢有关的一套操纵子的激活蛋白。CAP通过结合cAMP而形成活化的CAP－cAMP复合物，能结合到操纵子的启动子上或附近的特异CAP结合位点，帮助RNA聚合酶有效的结合到启动子上，提高形成封闭起始复合物的速度，从而提高了转录效率。CAP的作用位点在它调控的各种操纵子中都处于离开转录起始位点不同的距离。

物理图谱是DNA片段上限制性内切酶酶切位点的图谱，表示各种限制性内切酶识别位点在DNA序列上的线性排列。DNA一级结构的差异往往反映出物理图谱的不同。因此物理图谱是分子结构特征的反映，也是研究分子克隆不可缺少的条件。

遗传图谱通过遗传重组所得到的基因线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1%）来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，早期RFLP、RAPD、AFLP、；80年代后出现的有STR、和90、SNP、。

转录图谱利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱被称为转录图谱

CG岛基因组DNA中大部分CG二核苷酸对是高度甲基化的，但在仍有一簇簇稳定的非甲基化的CG小片段，称为CG岛，通常长度越1～2kbp，平均相距100kbp。特点是G＋C含量高，大多数CG岛缺乏甲基化。大约70％的CG岛与持家基因偶联，其他的出现在组织特异性基因内。CG岛还常常易于同转录机构的蛋白质因子相互作用。

阐述PCR的原理和方法P82
阐述cDNA文库的构建方法P54
阐述基因组文库的构建方法P58
阐述什么是基因突变？并说明产生基因突变有哪些途径？
阐述DNA修复系统
DNA修复(DNA repairing)是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存。原核和真核生物对于DNA的损伤都有很多的修复系统，如SOS系统。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。
(一)回复修复　这是较简单的修复方式，一般都能将DNA修复到原样。
1.光修复　这是最早发现的DNA修复方式。修复是由细菌中的DNA光解酶(photolyase)完成，此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体，并与其结合，这步反应不需要光；结合后如受300－600nm波长的光照射，则此酶就被激活，将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体，然后酶从DNA链上释放，DNA恢复正常结构。后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中，人体细胞中也有发现。
2.单链断裂的重接　DNA单链断裂是常见的损伤，其中一部分可仅由DNA连接酶(ligase)参与而完全修复。此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在，修复反应容易进行。但双链断裂几乎不能修复。
3.碱基的直接插入　DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)识别结合，在K＋存在的条件下，催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键，且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。
4.烷基的转移　在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。这个酶的修复能力并不很强，但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性。
(二)切除修复(excision repair)　是修复DNA损伤最为普遍的方式，对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中，也是人体细胞主要的DNA修复机制。修复过程需要多种酶的一系列作用，基本步骤如图16?1所示，①首先由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5′侧切开磷酸二酯键。不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割。②由5′→3′核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除。③在DNA聚合酶的催化下，以完整的互补链为模板，按5′→3′方向DNA链，填补已切除的空隙。④由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来。这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构。
(三)重组修复(recombinational repair)
上述的切除修复在切除损伤段落后是以原来正确的互补链为模板来合成新的段落而做到修复的。但在某些情况下没有互补链可以直接利用，例如在DNA复制进行时发生DNA损伤，此时DNA两条链已经分开，其修复可用图16?2所示的DNA重组方式：①受损伤的DNA链复制时，产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口。②另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换，将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处，而母链DNA出现缺口。③以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口，最后由DNA连接酶连接，完成修补。
重组修复不能完全去除损伤，损伤的DNA段落仍然保留在亲代DNA链上，只是重组修复后合成的DNA分子是不带有损伤的，但经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。
(四)SOS修复
“SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为错误倾向修复(error prone repair)，使细胞有较高的突变率。
当DNA两条链的损伤邻近时，损伤不能被切除修复或重组修复，这时在核酸内切酶、外切酶的作用下造成损伤处的DNA链空缺，再由损伤诱导产生的一整套的特殊DNA聚合酶SOS修复酶类，催化空缺部位DNA的合成，这时补上去的核苷酸几乎是随机的，但仍然保持了DNA双链的完整性，使细胞得以生存。但这种修复带给细胞很高的突变率。

阐述杆状病毒表达系统
阐述分离目的基因的方法
一、常用的目的基因克隆技术
1、通过已知基因产物的分析和鉴定
这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。
2、通过遗传表型分析
（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。
（2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编码的激发子与寄主抗病基因编码的受体之间存在不亲和的互作关系，以病原激发子蛋白为线索分离和克隆出一些几丁质抗病基因，如番茄与无毒基因avr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。
3、以图谱为基础的定位克隆技术
以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。
二、发展中的基因克隆新技术
1、从研究缺失突变体的表型着手分离基因
（1）核DNA消减法。该法主要是利用许多缺失突变体与其未缺失的同源亲本只有1-2个DNA片段的差异，通过将大量特殊标记的突变体DNA与少量未缺失亲本DNA相混合，变性后在适当温度下复性，待反应体系中的单链DNA重新配对成双链后，除去标记的突变体DNA和与之杂交配对的亲本DNA。如此几轮选择后，反应体系中最后只剩下在突变体核DNA中所缺失的那一段亲本DNA，最后对亲本特异DNA片段进行克隆。
(2)核DNA消减--PCR法。该法是核DNA消减法的发展，它将经特定限制性内切酶处理的未缺失亲本DNA（备测DNA）与大量经超声波切割、光敏生物素标记的突变体DNA(减法探针DNA)混合，经变性复性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球悬浮液除去各种杂合体，富集的亲本特异性DNA再经几轮筛选后加接头序列和T4DNA连接酶，然后加入单链接头序列作PCR引物进行PCR扩增，最后PCR产物直接克隆或32P标记后作探针与亲本DNA或核DNA文库杂交，确定出这些DNA片段所编码的基因，应用上述方法已分离出拟南芥菜与赤霉素合成有关的基因gal以及冰草的盐胁迫诱导基因等。
2、从大的基因组区域直接分离编码序列
真核生物基因组DNA中只有很小一部分编码mRNA，而大部分则为内含子、外显子和重复序列，目前通过大规模基因组测序来寻找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分离表达序列的方法中，cDNA捕捉法是较成功的一种方法，已用于许多基因的定位克隆。
（l）cDNA文库差示筛选法，这是一种直接分离组织或发育特异表达基因的方法，例如对于两种不同的组织细胞，先提取它们的poly(A)+mRNA，分别构建这两种组织的cDNA文库，然后以这些mRNA为模板，合成放射性标记的cDNA探针，再用这两种探针分别与一类cDNA文库的两套重复考贝杂交，跟两种探针都杂交的克隆是两种组织细胞中都表达的基因，而仅与一种探针杂交的克隆则是在一种组织细胞中特异表达的mRNA，再对这样的克隆进行测序比较和鉴定，就可分离到这种组织特异表达的基因。用这种方法已分离到许多根茎叶和生殖器官等特异表达的基因。
(2)cDNA捕捉法。cDNA捕捉法是一种以表达为基础的基因分离技术。它直接用基因组DNA如酵母人工染色体(YACs)捕捉cDNA片段，从而达到快速地从大的基因组区域分离表达序列。其主要技术是用PCR扩增来自不同组织的混合cDNA池或已克隆的cDNA文库，扩增的cDNA片段与用生物素随机标记的基因组目标DNA杂交，捕获亲和素标记磁珠上的与目标DNA杂交的cDNA片段，然后洗脱磁钵上捕获的cDNA并进行PCR扩增，再进行第二轮筛选，并将筛选出的cDNA片段克隆到载体上。
3、通过研究mRNA差异表达筛选克隆基因
　　1992年粱鹏等在mRNA差异表达通用方法即mRNA差减杂交技术基础上建立了mRNA差异显示反转录PCR技术(DDRT-PCR)，由于该技术所存在的缺陷和不足，已有许多研究在引物设计、Northern杂交和凝胶测序等方面对该技术进行了改进和优化，已发展了许多衍生的新技术，如用随机引物PCR扩增RNA指纹分析(RAP)、顺次差异显示法(ODD)、基因组差异显示法(GDD)、RC4D(RFLP一Coupled domain一direted DD)等。
mRNA的差异显示法已在发育和生理过程中差异表达基因的克隆方面得到广泛的应用，特别适用于进行数种平行材料之间的比较筛选。应用RC4D法可分析植物发育过程中某一组织的某一特定多基因家族不同成员的差异表达，如已从玉米花序中分离出6个雌雄花序中差异表达的MAD-box基因，从小麦和拟南芥中分别分离出HSP家族基因。
4、表型克隆法
表型克隆法是以mRNA为起始材料，利用RT-PCR和接头技术，对差异显示的基因带纹进行回收后作探针，在cDNA或基因组DNA文库中扫描筛选新的基因。这方面最新发展起来的技术主要有：cDNA差式分析法(RDA)、标签接头竞争PCR技术（ATAC一PCR）、抑制消减杂交法(SSH)、基因表达连续分析法(SAGE)、cDNA3'端限制酶切片段显示法(RFD)等，这些技术省去了分子标记定位分析的繁琐程序，并同时能分离多个未知产物的差异表达基因。
5、应用DNA芯片技术筛选新基因
DNA芯片技术是利用核酸杂交原理检测未知分子。它是由核酸片段如一系列用特定荧光标记的寡核苷酸探针，以预先设计排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成生物集成膜片，与不同标记的游离靶分子（DNA 或RNA）杂交，或生物集成膜片上的不同靶分子与游离的探针杂交，然后应用荧光信号检测器及处理器根据杂交分子或未杂交分子所发出的不同波长的光检测杂交信号。如完全杂交则发出强的荧光信号或特殊波长信号，不完全杂交信号较弱，若不能杂交则检测不到荧光信号或只检测到芯片上原有荧光信号。这些不同区域的荧光信号在芯片上组成荧光分布谱型，可被激光共聚焦显微镜激发和检测，经电脑软件处理检出DNA的序列及其变化。例如斯坦福大学从外周血淋巴细胞cDNA文库中用PCR法扩增插入基因，得到1046种未知序列扩增产物，将这些扩增产物作为靶DNA点样到经包被的玻片上，制成DNA芯片，经SDS、NaBH4等处理，95℃热变性后分别与热击T细胞及未处理T细胞的cDNA杂交，经激光共聚焦扫描系统分析，共发现17个差异表达的基因，其中11个是被热诱导的，其余6个是被热击抑制的，经序列分析表明其中3个为未发现的新基因。植物上最近已有应用cDNA芯片对草莓、矮牵牛进行基因表达的检测。
DNA芯片技术在发现新基因及分析各个基因在不同时空表达方面是一项十分有用的技术，已有学者对其在农业上的应用作了展望，如应用DNA芯片技术有望更深入地了解植物生长发育的内在机制、植物生长激素的作用机制、转基因工程株的实验室快速分析、了解小分子对基因表达的影响及加速DNA多态性的检测等。
综上所述的各种植物未知基因分离克隆技术，其研究和分析对象各有侧重且各有优缺点，有的在植物基因资源的研究开发上应用比较成熟，有的正逐渐应用到植物上。毫无疑问，发展中的这些植物基因分离技术在植物的分子生物学和基因工程中有着巨大的应用潜能，随着新的基因资源的不断发掘，作物的许多性状诸如产量、品质、抗性，植株的形态、熟期、花器发育的调节，以及一些复杂的生理生化性状等都可望得到进一步的改良。

阐述噬菌体表面展示技术及其应用
噬菌体表面展示(surface display)是一种基因表达筛选技术。即将目的基因克隆在特定的表达载体中，使基因表达产物呈现在活的噬菌体、细菌或细胞的表面，由此可直接检测表达产物的某些活性，并可根据其活性筛选、富集和克隆带有目的基因的噬菌体或细胞。噬菌体表面展示技术是由Smith 于1985年首先提出并建立和发展起来的利用丝状噬菌体在体外表达外源基因的一项新技术。
以经过改造的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白质基因pIII或PVIII 区，从而使表达的外源肽显露在噬菌体颗粒的表面，并使表达产物呈现良好的空间构型，由此提供可用亲和免疫纯化法筛选表达特异肽的噬菌体，并通过测定插入的DNA序列，可推断出目的基因所表达的肽的氨基酸序列。这样就可利用活的噬菌体方便而高效率地筛选目的基因，或检测基因产物的活性。这一技术是在对丝状噬菌体结构、基因组及其生命周期的深入研究的基础上发展起来的。表面展示技术已用于抗体基因文库、cDNA文库、随机多肽基因文库和突变基因文序的构建和筛选等研究。
利用表面展示技术构建的表达性基因文库，称为噬菌体呈现文库(phage dispplay library)。方法是利用呈现的多肽与特定的配基亲和结合的性质来高效率地筛选目的基因。一般先使亲相配基固项化，可将配基涂布在塑料板(如96孔板) 上或结合在琼脂糖珠〔或带铁芯的琼脂糖珠〕上，使文库的噬菌体与之反应，有亲合力的噬菌体就被固相化的配基所捕获，经过洗涤、洗脱的噬菌体可以再感染大肠杆菌而繁殖。这样的亲和结合、洗涤、洗脱、繁殖的富集过程称为“panning”，一轮panning可以富集10倍，经过几轮“panning”后就能从106～109的文库中筛选到目的克隆，其手续简便、快速、效率高，远非常规的表达性基因文库所能比拟。
噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体短肽库构建。它是将化学合成的随机寡核苷酸序列与噬菌体外壳蛋白III或VIII进行融合，从而将各种短肽表达于不同的噬菌体的表面。一般来讲，在蛋白分子之间，以及蛋白分子与其他分子之间识别并结合的过程中，肽的长度在8～12个氨基酸之间；其中主要作用的是5～8个氨基酸残基。因此目前所构建的噬菌体短肽库随机短肽的长度一般为6～10个氨基酸。该技术已经成功地应用于能够与特定的“靶”分子相结合的特异性短肽的筛选，如抗体分子、受体分子、核酸分子以及某些碳水化合物等。由于特异性短肽是通过其对固相化“靶”分子的亲和力来筛选的，因而该技术不需要项先知到任何肽类结构的信息。噬菌体短肽库技术在分子间相互识别的研究、新型疫苗的研制以及药物的开发等方面具有广泛的应用前景。
此外，表面展示技术可用于构建和筛选随机多肽基因文库(random peptide library)。通常基因文库都是从生物体内获取的，也可设计合成核苷酸随机排列的一段开读框，这样合成的“人工基因文库”容量很大，而且随机的人工基因编码多肽产物的功能多种多样甚至无法领言。但是这种随机排列的开放读框可插入噬菌体呈现载体，构建出随机多肽呈现文库，从文库中筛选人们所希望得到的东西，最常见的是获取具有特定亲合能力的多肽。例如用已有的单克隆抗体来筛选这种文库，从得到的结合配体去研究该单抗结合的抗原决定簇的结构，或获取对人生长激素、黏合素、生物素或抗生素等有高亲合力的多肽等。
表面展示技术用于抗体基因文库的构建和筛选，亦显示出很大的优越性。用PCR从人和动物的B淋巴细胞cDNA扩增得到抗体可变区基因片段，将它插入噬菌体呈现载体．可以构建到全套抗体可变区或Fab段基因表面呈现文库。从这些文库中不经过杂交瘤，其至不经过免疫就可以方便地获得特异地结合不同抗原的FV或Fab段抗体，这是单克隆抗体技术发展的新的里程碑。从其他组织得到的cDNA也可插入噬菌体呈现载体，构建cDNA表达呈现文库，以此可筛选出表达有生物活性产物的克隆。
既然能从全套抗体基因文库或随机多肽基因文库中筛选得到任何针对某—配基的配体，也就有可能把此法作为寻找新药物或新试剂的途径。例如，有人利用此法来寻找艾滋病毒某些蛋白质有亲合力的多肽或对某些酶的抑制剂，用于对该病诊断与治疗。
利用表面展示技术不仅能开发新药和试剂，还以改善实验或检测手段；代表是商品化的抗体基因库构建专利的噬菌体呈现载体及其克隆、筛选试剂药盒的出现。在抗病毒应用研究方面，在一些重要病毒的抗原表位分析、抗病毒抗体、病毒受体等研究方面取得令人满意的研究结果。这一研究及应用将对病毒病的检测、新型抗病毒药物的筛选及鉴定、病毒疫苗的合理设计及新一代疫苗的开发等，都将起到巨大的推动作用。表面呈现技术正在不断地发展，表面呈现技术不限于丝状噬菌体，其他噬菌体，甚至大肠杆菌的lamB基因也能用于构建成表面呈现的载体，其中许多领域还有待开发研究。

阐述酵母双杂交系统原理及其应用
酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域（DNA binding domain，DNA-BD）和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）共同完成的，这两个结构域通过共价或非共价连接建立的空间联系是导致结合和激活发生的关键。根据这一特点，如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成融合蛋白的形式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。
酵母转录因子GAL4的两个DNA结合功能域(DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结构域（activation domain，DNA-AD）分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。
迄今为止，应用于筛选基因的双杂交体系已发展出很多版本。经验证明，应用不同体系进行检测的灵敏差异主要取决于控制报告基因表达的启动子和DNA结合序列的特点以及两种融合蛋白在酵母中的表达量。
作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白质在体研究体系，双杂交系统主要应用于：
①验证通过其他方法发现的蛋白质间可能的相互作用；
②确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸；
③筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质。
由于具有相对简便、快速及不经蛋白质纯化即可相接获得编码基因的特点，采用双杂交体系从cDNA文库和基因文库中直接筛选出蛋白质间相互作用成为它最具优势之处。由此而鉴定的各种受体、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及参与细胞周期调控、肿瘤发生的蛋白质已不胜枚举。

RNAi实验原理与方法
一、RNAi的分子机制
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制。 RNAi的机制可能是双链RNA进入细胞后，在Dicer酶的作用下，被切割成21-23 bp大小的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活的RISC可以精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。
由于少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统。研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增。
双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。
二、如何进行RNAi试验
(一)siRNA的设计
1. 在设计RNAi实验时，可以先在以下网站进行目标序列的筛选：
2.RNAi目标序列的选取原则：
(1)从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45%—55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。建议在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。
(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。
(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
3.阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
4.参考目前已证实的siRNA。
(二)siRNA的制备
目前为止较为常用的方法有通过化学合成，体外转录，长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)体外制备siRNA，以及通过siRNA表达载体或者病毒载体，PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达产生siRNA。
体外制备
1.化学合成许多国外公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高。
最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究
不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素
2.体外转录
以DNA Oligo为模版，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制，虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs，但是反应规模和量始终有一定的限制。还需要占用研究人员相当的时间。值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。
最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。
不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究。
3.用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
dsRNA消化法的主要优点在于可以跳过检测和筛选有效siRNA序列的步骤，为研究人员节省时间和金钱（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不过这种方法的缺点也很明显，就是有可能引发非特异的基因沉默，特别是同源或者是密切相关的基因。现在多数的研究显示这种情况通常不会造成影响。
最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型；
不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗
体内表达
前面的3种方法主要都是体外制备siRNAs，并且需要专门的RNA转染试剂将siRNAs转到细胞内。而采用siRNA表达载体和基于PCR的表达框架则属于：从转染到细胞的DNA模版中在体内转录得到siRNAs。这两种方法的优点在于不需要直接操作RNA。
4. siRNA表达载体
多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。
siRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。
病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便,而且转染效果更加稳定。
最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默。
不适用于：筛选siRNA序列（其实主要是指需要多个克隆和测序等较为费时、繁琐的工作）。
5. siRNA表达框架
siRNA表达框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模版，包括一个RNA pol III启动子，一段发夹结构siRNA，一个RNA pol III终止位点，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。和siRNA表达载体不同的是，SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到，不用一天的时间。因此，SECs成为筛选siRNA的最有效工具，甚至可以用来筛选在特定的研究体系中启动子和siRNA的最适搭配。如果在PCR两端添加酶切位点，那么通过SECs筛选出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到载体中构建siRNA表达载体。构建好的载体可以用于稳定表达siRNA和长效抑制的研究。
这个方法的主要缺点是①PCR产物很难转染到细胞中②不能进行序列测定，PCR和DNA合成时可能差生的误读不能被发现导致结果不理想。
最适用于：筛选siRNA序列，在克隆到载体前筛选最佳启动子
不适用于：长期抑制研究。（如果克隆到载体后就可以了）
(三)siRNA的转染
将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：
1.磷酸钙共沉淀
将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5.阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
1.纯化siRNA
在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
4.避免使用抗生素
抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。
5.选择合适的转染试剂
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。
6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。
7.通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
三、RNAi的应用前景
1. 研究基因功能的新工具
已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中灭活或降低特异性基因的表达，制作多种表型，而且抑制基因表达的时间可以随意控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。线虫和果蝇的全部基因组序列已测试完毕，发现大量未知功能的新基因，RNAi将大大促进对这些新基因功能的研究。与传统的基因敲除技术相比，这一技术具有投入少，周期短，操作简单等优势，近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。
2. 研究信号传导通路的新途径
联合利用传统的缺失突变技术和RNAi技术可以很容易地确定复杂的信号传导途径中不同基因的上下游关系，Clemensy等应用RNAi研究了果蝇细胞系中胰岛素信息传导途径,取得了与已知胰岛素信息传导通路完全一致的结果,在此基础上分析了DSH3PX1与DACK之间的关系, 证实了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点，因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径。
3.开展基因治疗的新策略
RNAi具有抵抗病毒入侵，抑制转座子活动，防止自私基因序列过量增殖等作用，因此可以利用RNAi现象产生抗病毒的植物和动物，并可利用不同病毒转录序列中高度同源区段相应的dsRNA抵抗多种病毒。
肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长, 而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性, 设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。
尽管目前RNAi技术在哺乳动物中的应用还处于探索阶段，但它在斑马鱼和老鼠等脊椎动物中的成功应用预示着RNAi将成为基因治疗中重要的组成部分，人工合成的dsRNA寡聚药物的开发将可能成为极具发展前途的新兴产业。

一、胰岛素的信号转导途径
胰岛素(包括IGFI、IGFII) 信号所激发的信号传递途径主要有二,一为Ras-MAPK途径，一为PI3-激酶途径。
(一) Ras-MAPK途径　当胰岛素或IGF 与胰岛素受体结合后，引起受体自身磷酸化而活化（酪氨酸激酶的活性），活化的受体使胞质内的胰岛素受体底物(IRS) IRS-1和SHc等的酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的酪氨酸残基结合Grb2的SH2结构域，Grb2的SH3结构域又可与Sos 结合并使之活化，激活的Sos即可与质膜上的Ras相结合。Sos具有鸟苷酸交换因子( GEF) 的作用，使Ras释放结合的GDP，结合GTP而活化。Ras 的下游信息传递是一系列蛋白激酶的级联传递和放大过程。活化的Ras-GTP与Raf的N端结构域结合并使之活化，Raf是丝氨酸/ 苏氨酸蛋白激酶（MAPKKK），活化Raf结合并激活另一种蛋白激酶MAPKK，它可结合并磷酸化有丝分裂原活化蛋白激酶MAPK (mitogen－activated protein kinase，MAPK)的第185位酪氨酸残基及第183位苏氨酸残基，而使之激活。活化的MAPK进入细胞核，可使EIK-1、RNA 聚合酶II等许多转录因子活化，进而促进c-fos，c-jun的表达。
Ras-MAPK信号通路可概括如下：
配体→RPTK→adaptor（如Grb2）→GEF→Ras→Raf（MAPKKK）→MAPKK
→MAPK→进入细胞核→转录因子→基因表达。
通过Ras-MAPK传递途径可促使靶细胞基因表达，导致细胞生长、增殖及分化。

(二) 磷脂酰肌醇3-激酶( PI3-K) 途径　 PI3-K 的SH2 结构域能与含磷酸酪氨酸残基的信号分子如IRS-1 结合，SH3 结构域能与富含脯氨酸的各种信号蛋白结合。当胰岛素或IGF作用于胰岛素受体后, PI3-K 与酪氨酸磷酸化的IRS-1 结合，激活催化活性，PI3-K的靶蛋白是蛋白激酶B ( PKB) 。PKB 是Ser/ Thr 蛋白激酶家族的成员,。当胰岛素及IGF 作用于靶细胞时迅速引起PKB 的活化，并使PKB从细胞膜脱落，进入胞质，进而对胞质内的靶蛋白发挥作用。PKB的靶蛋白有：磷酸果糖激酶-2，与糖酵解的调控有关；糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)；受PKB磷酸化后GSK3活性降低，再使糖原合成酶因磷酸化减少而活性增加，从而导致糖原合成增加。此外, GSK3与mRNA 转录起动的活化也有关。参与细胞凋亡的Bad蛋白也是PKB 的底物，PKB使Bad磷酸化而转变成无活性形式，从而抑制细胞凋亡。此外, PKB 还与葡萄糖的转运、细胞增殖、分化及细胞周期的调节等有关。
二、JAK-STAT 信号转导途径
JAK（just another kinase 或janus kinase）是一类非受体酪氨酸激酶家族，已发现四个成员，即JAK1 、JAK2 、JAK3 和TYK1，其结构不含SH2 、SH3，C 段具有两个相连的激酶区。
JAK 的底物为STAT，即信号转导子和转录激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT），具有SH2 和SH3 两类结构域。STAT 被JAK 磷酸化后发生二聚化，然后穿过核膜进入核内调节相关基因的表达，这条信号通路称为JAK-STAT 途径
JAK-STAT 途径
1、配体与受体结合导致受体二聚化；
2、二聚化受体激活JAK；
3、JAK 将STAT 磷酸化；
4、STAT 形成二聚体，暴露出入核信号；
5、STAT 进入核内，调节基因表达。

噬菌体表面展示(surface display)是一种基因表达筛选技术。即将目的基因克隆在特定的表达载体中，使基因表达产物呈现在活的噬菌体、细菌或细胞的表面，由此可直接检测表达产物的某些活性，并可根据其活性筛选、富集和克隆带有目的基因的噬菌体或细胞。噬菌体表面展示技术是由Smith 于1985年首先提出并建立和发展起来的利用丝状噬菌体在体外表达外源基因的一项新技术。
以经过改造的噬菌体为载体，把外源基因插入噬菌体外壳蛋白质基因pIII或PVIII 区，从而使表达的外源肽显露在噬菌体颗粒的表面，并使表达产物呈现良好的空间构型，由此提供可用亲和免疫纯化法筛选表达特异肽的噬菌体，并通过测定插入的DNA序列，可推断出目的基因所表达的肽的氨基酸序列。这样就可利用活的噬菌体方便而高效率地筛选目的基因，或检测基因产物的活性。这一技术是在对丝状噬菌体结构、基因组及其生命周期的深入研究的基础上发展起来的。表面展示技术已用于抗体基因文库、cDNA文库、随机多肽基因文库和突变基因文序的构建和筛选等研究。
利用表面展示技术构建的表达性基因文库，称为噬菌体呈现文库(phage dispplay library)。方法是利用呈现的多肽与特定的配基亲和结合的性质来高效率地筛选目的基因。一般先使亲相配基固项化，可将配基涂布在塑料板(如96孔板) 上或结合在琼脂糖珠〔或带铁芯的琼脂糖珠〕上，使文库的噬菌体与之反应，有亲合力的噬菌体就被固相化的配基所捕获，经过洗涤、洗脱的噬菌体可以再感染大肠杆菌而繁殖。这样的亲和结合、洗涤、洗脱、繁殖的富集过程称为“panning”，一轮panning可以富集10倍，经过几轮“panning”后就能从106～109的文库中筛选到目的克隆，其手续简便、快速、效率高，远非常规的表达性基因文库所能比拟。
噬菌体展示技术的成功应用之一就是噬菌体短肽库构建。它是将化学合成的随机寡核苷酸序列与噬菌体外壳蛋白III或VIII进行融合，从而将各种短肽表达于不同的噬菌体的表面。一般来讲，在蛋白分子之间，以及蛋白分子与其他分子之间识别并结合的过程中，肽的长度在8～12个氨基酸之间；其中主要作用的是5～8个氨基酸残基。因此目前所构建的噬菌体短肽库随机短肽的长度一般为6～10个氨基酸。该技术已经成功地应用于能够与特定的“靶”分子相结合的特异性短肽的筛选，如抗体分子、受体分子、核酸分子以及某些碳水化合物等。由于特异性短肽是通过其对固相化“靶”分子的亲和力来筛选的，因而该技术不需要项先知到任何肽类结构的信息。噬菌体短肽库技术在分子间相互识别的研究、新型疫苗的研制以及药物的开发等方面具有广泛的应用前景。
此外，表面展示技术可用于构建和筛选随机多肽基因文库(random peptide library)。通常基因文库都是从生物体内获取的，也可设计合成核苷酸随机排列的一段开读框，这样合成的“人工基因文库”容量很大，而且随机的人工基因编码多肽产物的功能多种多样甚至无法领言。但是这种随机排列的开放读框可插入噬菌体呈现载体，构建出随机多肽呈现文库，从文库中筛选人们所希望得到的东西，最常见的是获取具有特定亲合能力的多肽。例如用已有的单克隆抗体来筛选这种文库，从得到的结合配体去研究该单抗结合的抗原决定簇的结构，或获取对人生长激素、黏合素、生物素或抗生素等有高亲合力的多肽等。
表面展示技术用于抗体基因文库的构建和筛选，亦显示出很大的优越性。用PCR从人和动物的B淋巴细胞cDNA扩增得到抗体可变区基因片段，将它插入噬菌体呈现载体．可以构建到全套抗体可变区或Fab段基因表面呈现文库。从这些文库中不经过杂交瘤，其至不经过免疫就可以方便地获得特异地结合不同抗原的FV或Fab段抗体，这是单克隆抗体技术发展的新的里程碑。从其他组织得到的cDNA也可插入噬菌体呈现载体，构建cDNA表达呈现文库，以此可筛选出表达有生物活性产物的克隆。
既然能从全套抗体基因文库或随机多肽基因文库中筛选得到任何针对某—配基的配体，也就有可能把此法作为寻找新药物或新试剂的途径。例如，有人利用此法来寻找艾滋病毒某些蛋白质有亲合力的多肽或对某些酶的抑制剂，用于对该病诊断与治疗。
利用表面展示技术不仅能开发新药和试剂，还以改善实验或检测手段；代表是商品化的抗体基因库构建专利的噬菌体呈现载体及其克隆、筛选试剂药盒的出现。在抗病毒应用研究方面，在一些重要病毒的抗原表位分析、抗病毒抗体、病毒受体等研究方面取得令人满意的研究结果。这一研究及应用将对病毒病的检测、新型抗病毒药物的筛选及鉴定、病毒疫苗的合理设计及新一代疫苗的开发等，都将起到巨大的推动作用。表面呈现技术正在不断地发展，表面呈现技术不限于丝状噬菌体，其他噬菌体，甚至大肠杆菌的lamB基因也能用于构建成表面呈现的载体，其中许多领域还有待开发研究。

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沙发发表于: 2008-11-28

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板凳发表于: 2008-11-29

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zfwzdazhi

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地板发表于: 2008-11-29

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怎么这么多，是复习资料吗？

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zfwzdazhi

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地下室发表于: 2008-11-29

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