文字文字文字医学考试中基础和临床都经常考的一门专业课,-------生物化学(沈同)笔记下载 M}f(-,9
§4.其它脂类 X J)Y-7c
一.结合脂 I~@8SSO,vH
1.糖脂 7')W+`o8eL
<1>.甘油糖脂:甘油磷脂的磷酸X被糖所取代的产物,即第三个羟基与糖的半缩醛羟基脱水缩合的产物(P39),因此,也属于糖苷。 8N?D1;F;
<2>.糖鞘脂:鞘磷脂的磷酸+胆碱被糖所取代的产物,糖也是出的半缩醛羟基,也属于糖苷。例如:脑苷脂和神经节苷脂P47(霍乱毒素受体GMI)等。 KB(W'M_D\
2.脂蛋白:血液中的四种脂蛋白。 jlFlhj:/I
二.固醇类:环戊烷多氢菲的衍生物P42。编号 (V]3w
功过是非:癌症(黄曲霉素),心血管疾病(高血压),结石;脑细胞、胆汁酸、激素、VD。 "
42/P4:
固醇(甾醇):环戊烷多氢菲上3位接-OH,10、13位上接-CH3,17位上接一烷链P42。 f5FEHyj|
<1>.胆固醇:固醇上的17位上接一异辛烷P43。游离胆固醇和胆固醇脂均不溶于水。 ;l
ZKgi8`
胆固醇在紫外线的作用下可以转化成VD,VD的作用,婴儿晒太阳。 ?+^p$'5
<2>.胆汁酸:胆固醇衍生的一类固醇酸。 kLZVTVSJt
胆酸:P43略 (;%T]?<9#
三.萜类:异戊二烯的衍生物P45,衍生方式为异戊二烯首尾相连或尾尾相连P45+。 [|=M<>?[
单萜(2个异戊二烯单位)、倍半萜(3个异戊二烯单位),β-胡罗卜素为4萜,天然橡胶为上千萜。 f:<BUqa
FiUwy/,ZV
霍乱病: !$oa6*<1
病征:上吐下泻,全是水,若不补充水,一天之内即死亡 hpb|| V
病理:肠内大量失水,水压过高,排泄物中有大量的霍乱弧菌。 Y%;X7VxU*
分子基础:小肠上皮细胞的外表面结构如图(讲义稿P5),具有霍乱毒素的受体,霍乱毒素的结构是个七聚体蛋白,与受体结合后解离,穿过细胞膜,刺激腺苷酸环化酶,提高cAMP,使钠/水泵失调,向肠内排水,又向周围组织以及血管中抽水。 9Ffam#
fs&$?mHL){
AJxN9
[Z!N
第四章 蛋白质 -bzlp7q*
一.蛋白质是生命的表征,哪里有生命活动哪里就有蛋白质 &{a!)I>
1.酶:作为酶的化学本质,温和、快速、专一,任何生命活动之必须,酶的另一化学本质是RNA,不过它比蛋白质差远了,种类、速度、数量。 "8ellKh
2.免疫系统:防御系统,抗原(进入“体内”的生物大分子和有机体),发炎。 dX@ic,?
细胞免疫:T细胞本身,分化,脓细胞。 $S|+U}]C
体液免疫:B细胞,释放抗体,导弹,免疫球蛋白(Ig)。 m{ !$_z8:
3.肌肉:肌肉的伸张和收缩靠的是肌动蛋白和肌球蛋白互动的结果,体育生化。 tjb$MW$('
4.运输和储存氧气:Hb和Mb。 fJc(
5.激素:含氮类激素,固醇类激素。 `@],J
6.基因表达调节:操纵子学说,阻遏蛋白。 S3
Gr}N
7.生长因子:EGF(表皮生长因子),NGF(神经生长因子),促使细胞分裂。 =CK% Zo
8.信息接收:激素的受体,糖蛋白,G蛋白。 B=& [Z2
9.结构成分:胶原蛋白(肌腱、筋),角蛋白(头发、指甲),膜蛋白等。生物体就是蛋白质堆积而成,人的长相也是由蛋白质决定的。 B?=R= p
10.精神、意识方面:记忆、痛苦、感情靠的是蛋白质的构象变化,蛋白质的构象分类是目前热门课题。
6dr'nP
11.蛋白质是遗传物质?只有不确切的少量证据。如库鲁病毒,怕蛋白酶而不怕核酸酶。 B #%QY\<X
二.构成蛋白质的元素 r*vh3.Agl
1. 共有的元素有C、H、O、N, 其次S、稀有P等 =JzzrM|V*
2. 其中N元素的含量很稳定,16%,因此,测N量就能算出蛋白质的量(实验四,修改预定表)。 |7c],SHm
三.结构层次 lt6wmCe
1. 一级结构:AA顺序 GEc-<`-
2. 二级结构:主干的空间走向 E0+L?(;
3. 三级结构:肽链在空间的折叠和卷曲形成的形状,所有原子在空间的排布。 ~
O#\$u
4. 四级结构:多条肽链之间的作用。 81{8F
$`3yImv+w
§1.氨基酸 蛋白质的结构单位、水解产物 0<!9D):Bb
一.氨基酸的结构通式:P50 [S,$E6&j$"
α-碳原子,α-羧基,α-氨基 )Su>8f[?e
氨基酸的构型:自然选择L型, D型氨基酸没有营养价值,仅存在于缬氨霉素、短杆菌肽等极少数寡肽之中,没有在蛋白质中发现。 >
UZ-['H
二.氨基酸的表示法 3Ji
zv
,?
生物体中有20种基本氨基酸(合成蛋白质的原料),还有其它非基本氨基酸,20种基本氨基酸的表示方法有下列几种: c8X;4
My
1. 中文名:X(X)氨酸,如甘氨酸、半胱氨酸。20种要会背。 { im?tZ,
2. 英文名:3字名,如Gly、Cys等,20种要会背。 azv173XZ
3. 按顺序演示,记忆技巧。 hb3:,c(
Ala Arg Asp Asn Cys Glu Gln Gly His Ile (yP1}?
丙 精 天 天冬酰氨 半 谷 谷氨酰氨 甘 组 异亮 #Pg`0xiV
Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val Pq [_(Nt
亮 赖 甲硫 苯丙 脯 丝 苏 色 酪 缬 md+pS"8o;
({t^/b*8
三.氨基酸的具体结构:20种全部记住,仅注意R。 UV D D)
P51~53 JyE-c}I
讲解顺序: N~$>| gn
甘Gly(最特殊,唯一无旋光性)、丙Ala(顾名思义)、苯丙Phe(顾名思义)。 H^n@9U;[K
酪Tyr(有β-苯酚基)、半胱Cys(β-巯基)、丝Ser(β-羟基)、苏Thr(β-羟基)、天冬Asp(酸性氨基酸,β-羧基)、天冬酰氨Asn(β-酰氨)、色Trp(β-吲哚基P66)、组His(β-咪唑基P66)。 68u?}8}
谷Glu(酸性氨基酸,γ-羧基)、谷氨酰氨Gln(γ-酰氨)、甲硫Met(γ-甲硫基)。 pmB
{b
金Arg(δ-胍基P66)。
.?6p~
赖Lys(碱性氨基酸,ε-氨基)。 tI{]&dev
缬Val、亮Leu、异亮Ile:都是烷烃链。 `qs,V
脯Pro(亚氨基)。 $f3 IO#
N
_ZhQY,
四.氨基酸的分类 2QaE&8vW
1.结构上 DW7E ]o
<1>脂肪族氨基酸:酸性氨基酸(2羧基1氨基:Glu、Asp),碱性氨基酸(2氨基1羧基:Arg、Lys),中性氨基酸(氨基羧基各一:很多) T)I)r239h
<2>芳香族氨基酸:含苯环:Phe、Tyr iRrUIWx
<3>杂环氨基酸: His(也是碱性氨基酸)、Pro、Trp *`+zf7-f
2.R基的极性 O +o)z6(
<1>极性氨基酸:亲水氨基酸:溶解性较好,酸性氨基酸、碱性氨基酸、含巯基、羟基、酰胺基的氨基酸,Glu、Asp、Arg、Lys、His、Cys、Ser、Thr、Tyr、Gln、Asn ZXb|3|D
<2>非极性氨基酸:疏水氨基酸:溶解性较差,具有烷烃链、甲硫基、吲哚基等的氨基酸,Gly、Ala、Leu、Ile、Val、Pro、Met、Trp mh}D[K=~%
3.营养价值 !rRBy3&
<1>必需氨基酸:人和哺乳动物不可缺少但又不能合成的氨基酸,只能从食物中补充,共有8种:Leu、Lys、Met、Phe、Ile、Trp、Thr、Val Py
v>
<2>半必需氨基酸:人和哺乳动物虽然能够合成,但数量远远达不到机体的需求,尤其是在胚胎发育以及婴幼儿期间,基本上也是由食物中补充,只有2种:Arg、His。有时也不分必需和半必需,统称必需氨基酸,这样就共有10种。记法:Tip MTV Hall D?_K5a&v,
<3>非必需氨基酸:人和哺乳动物能够合成,能满足机体需求的氨基酸,其余10种 M6p\QKi
从营养价值上看,必需>半必需>非必需 nIg 88*6b,
五.非基本氨基酸 UPGUJ>2Z
1. 氨基酸的衍生物:蛋白质化学修饰造成的,有P-Ser、P-Thr、P-Tyr、OH-Pro、OH-Lys,最为重要的是Cyss胱氨酸,是由2分子Cys通过二硫建连接起来的,P54 u1X^#K$nu'
2. 非蛋白氨基酸:仅游离存在,瓜氨酸、鸟氨酸、β-丙氨酸 W Csf_1
3. D-氨基酸:缬氨霉素、短杆菌肽中含有。 e7GYz7
VVSt,/S O
六.氨基酸的性质 ,]1f)>
1. 物理性质 zk{d*gN
<1>紫外吸收:有共轭双键的物质都具有紫外吸收,在20种基本aa中,有4种是具有共轭双键的,Trp、Tyr、Phe、His,其中His只有2个双键共轭,紫外吸收比较弱,Trp、Tyr、Phe均有3个双键共轭,紫外吸收较强,其中Trp的紫外吸收最厉害,是蛋白质紫外吸收特性的最大贡献者,此3种氨基酸的紫外吸收特点如下: rNV3-#kU
Aa(氨基酸) Λm(最大吸收波长:nM) E(消光系数:A/Mol/L) 5vLXMdN
Phe 257 2*102 /HRKw
D
Tyr 275 1.4*103 k( 0; >)<i
Trp 280 5.6*103 Q8`V0E\~
<2>旋光性:仅Gly不具旋光性,其它19种都有,且自然选择为L-型。 B$rhsK%
<3>溶解性:溶解于水,特别是稀酸稀碱溶液,不溶于乙醚、氯仿等有机溶剂。 NC~?4F[
<4>熔点:均大于200℃,也就是说氨基酸都是固态,而同等分子量的其它有机物则是液态,这说明了氨基酸与氨基酸之间的结合力很强,是离子键,即氨基酸是以离子状态存在的,而不是以中性分子存在的。 !nl-}P,
=%
~- M
2.化学性质 3]vVuQK .
<1>解离和等电点: q!Ek
EW\n
氨基酸是个两性电解质,既可进行酸解离也可进行碱解离,用解离方程式表示就是:见P57,这样,氨基酸在水溶液中就可能带电,+或-,以及呈电中性,到底是什么情况,完全由溶液的PH值来决定。 %/I:r7UR{
等电点:如果调节溶液的PH值使得其中的氨基酸呈电中性,我们把这个PH值称为氨基酸的等电点:PI。PI是氨基酸的重要常数之一,它的意义在于,物质在PI处的溶解度最小,是分离纯化物质的重要手段。 _3%$E.Q
思考题: #,z-Pj?O!
当溶液的PH值>PI时,aa带电为+/-? >s/_B//[
当溶液的PH值 q<3La(^/
aa溶于蒸馏水中后,溶液的PH值变为6,此aa的PI>=<6? 0qNk.1pv
aa溶于蒸馏水中后,溶液的PH值变为8,此aa的PI>=<8? -sA&1n"W&5
[4#HuO@h
<2>等电点的计算:对于所有的R基团不解离的氨基酸而言(即解离只发生在α-羧基和α-氨基上),计算起来非常简单: h.R46 :
PI=(PK1’+PK2’)/2 L[2N zwO
若是碰到R基团也解离的,氨基酸就有了多级解离,这个公式就不好用了,比如Lys、Glu、Cys等。 82,^Pu
aa Cys Asp Glu Lys His Arg H_f8/H
PK’α-羧基 1.71 2.69 2.19 2.18 1.82 2.19 J
#C4A]A
PK’α-氨基 8.33 9.82 9.67 8.95 9.17 9.04 Nsh/
PK’-R-基团 10.78(-SH) 3.86(β-COOH) 4.25(γ- COOH) 10.53(ε-NH2) 6(咪唑基) 12.48(胍基) 1f+A_k/@
ng+sK
在这种情况下可以按下面的步骤来计算: <VD7(j]'^
<1> 由PK’值判断解离顺序,总是PK1’< PK2’< PK3’< …,即谁的PK’值小,谁就先解离。 2fkyz
<2> 按照解离顺序正确写出解离方程式:简式,注意解离基团的正确写法。 X[h{g`
<3> 找出呈电中性的物质,其左右PK’值的平均值就是氨基酸的等电点: Mw,]Pt6~i
PI=(PK左’+PK右’)/2 M
0}r)@
以Lys为例:在黑板上用简式演示 8B-PsS|'
<3>等电点的测定:等电聚焦法:这是一种特殊的电泳,其载体上铺有连续的PH梯度的缓冲液,然后将氨基酸点样,只要该处的PH与氨基酸的PI不同,则氨基酸就会带电,PH值>PI时,aa带-电;PH值<="" span="" /> 5)Z=FUupA~
4>氨基酸的重要化学反应 k'%yvlv
反应基团 试剂 主要产物 应用 P v\bWQs1
α-NH2 茚三酮 紫色、红色物 对氨基酸显色 63 e+!xy&u@u
α=NH2 茚三酮 黄色物 Pro的鉴定 T"htWo{v>
α-NH2 HNO2 N2等 游离aa定量,蛋白质水解程度 59 l4$ sku-
α-NH2 DNFB二硝基氟苯Sanger试剂 DNP-aa二硝基苯黄色物 蛋白质N端测定一级结构分析标准图谱 6181 O1jiD_Y!9
α-NH2 PITC苯异硫氰酸酯Edman试剂 PTC-aa在无水的酸中环化成PTH-aa 蛋白质N端测定一级结构分析aa顺序自动分析仪标准图谱 82 (7<G1$:z=
α-NH2 甲醛 羟甲基-aa和二羟甲基-aa 甲醛滴定aa含量(封闭氨基) 60 bK }ZR*)
Arg的胍基 α-萘酚次溴酸钠坂口试剂 桃红色物 鉴定Arg L44|/~
Met的-S-CH3 H2O2 过氧化物 吸烟有害,烟中的过氧化物,弹性蛋白酶,抑制剂Met,肺气肿。 HdlOGa6C
Cys的-SH 碘代乙酸ICH2COOH过甲酸HCOOOH 乙酸硫基HOOC-CH2-S-磺基HS3O- 肽链拆分,作用与CYSS上的二硫键 65 &V
7J5~_
His的咪唑基 重氮苯磺酸Pauly试剂 樱红色物(1His连2重) 鉴定His 65-66 JcYY*p
Tyr的酚基 重氮苯磺酸Pauly试剂 桔黄色物 鉴定Tyr "uuM#@h
Tyr的酚基 磷钼酸、磷钨酸Folin试剂 兰色物质 定量测定蛋白质、Tyr VXZYRr3F
Trp的吲哚基 对二甲基氨基苯甲醛 兰色物质 鉴定Trp 4P?`<
K'
-OHSer、Thr、Tyr 激酶、ATP P-aa 调节酶的活性,测定酶的活性中心 65 ;\}dQsX
#*9 |\
fX:q]
§2.肽 ';\norx;
一.肽与肽键
TR*vZzoy
氨基酸的羧基与另一氨基酸氨基脱水缩合形成的化合物就是肽,其实就是一种酰胺化合物,其酰胺键就是肽键,它的特点是刚性平面、反式构型。见补页。 v B~VJKD
肽中的氨基酸叫氨基酸残基,几个氨基酸残基就叫几肽。 @VHstjos^V
二.肽的种类 61QA<Wb
寡肽:2-10,无构象,谷胱甘肽是3肽 Jm)7!W%3
多肽:10-50,介于之间,胰高血糖素是29肽 xX<T5Ls
蛋白质:50以上,有特定的构象,胰岛素是51肽 Ar~<l2,{r
三.肽的表示法 ?{ \7th37
1. N端、C端的概念:肽链的两个端点,N端的氨基酸残基的α-氨基未参与肽键的形成,C端的氨基酸残基的α-羧基未参与肽键的形成。 )$1j"mV
2. 写法和读法:规定书写方法为N端→C端,例如:Ala-Gly-Phe,读作:丙氨酰甘氨酰苯丙氨酸。 8[,R4@
注意有时会看到一些奇怪的写法,比如:NH2-Ala-Gly-Phe-COOH,或H-Ala-Gly-Phe-OH,均属于画蛇添足,但Ala-Gly-Phe- NH2则表示C端被酰胺化了。 nF]E":
若有必要从C端→N端写,则必须标明,如(C)Phe- Gly –Ala(N) J"h2"$v,
四.肽的性质 W\0u[IV.x
1.酸碱性:肽至少有一个游离的氨基和游离的羧基,也是两性化合物,至少有2级解离,通常都有多级解离。因此,肽在水溶液中也能够带电,也有自己的等电点PI,其计算与测定完全同氨基酸的。 IC"ktv bHz
例如:谷胱甘肽,Glu-Cys-Gly,其结构见P72,注意Glu-Cys之间的肽键(γ-,而不是正常的α-),各解离基团的PK’值见P72,PI=(2.13+2.34)/2=2.235,很酸。 q},,[t
2.双缩脲反应:见笔记P33,双缩脲(相似于三肽,即2个肽键)、碱性铜离子、紫红色化合物。凡大于三肽的肽都能发生此反应,2肽不行。 % &H^UxC
3.水解反应:肽可以被酸、碱、酶所水解,其优劣性如下: %@ >^JTkY8
<1>酸水解:浓酸(6N以上,解释一下N=M/价),高温(110℃以上),长时(24-36小时),污染,Trp遭到破坏,不消旋,水解彻底 hN0h'JJ[7
<2>碱水解:浓碱(6N以上),高温(100℃以上),6小时,污染,含-OH和-SH的氨基酸均遭到破坏,Ser、Thr、Tyr、Cys,消旋,水解彻底。 E}%Pwr
<3>酶水解:胰酶,常温常压,常PH,不消旋、不破坏、不彻底。 [vuikJP>1k
常用的蛋白酶,即工具酶: ro?.w
外切酶:氨肽酶:从N端开始一个个水解肽键 #D(=[F
羧肽酶:从C端开始一个个水解肽键: !]7b31$M_
羧肽酶A:Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基 w(S&X"~
羧肽酶B:仅Arg、Lys n]3'N58
羧肽酶C:所有的氨基酸残基 ~ [/jk !G
内切酶:胰蛋白酶:仅作用于Arg、Lys的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。产物为C端Arg、Lys的肽链。 /_expSPHl
糜蛋白酶:仅作用于含苯环的氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。 Trp、Tyr、Phe,产物为C端Trp、Tyr、Phe的肽链。 6Rif&W.xy
五.肽的实例 o[JZ>nm
1.谷胱甘肽:其结构见P72,注意Glu与Cys的连接(γ-,而不是正常的α-),还原型GSH和氧化型GSSG,多种酶的激活剂,参与体内多项代谢,主要作用是还原剂,消除体内的自由基(过氧化物,抽烟,黑坳)。 txMC^-J2l
2.催产素和加压素:9肽或环8肽,都是脑垂体后叶激素,结构见《生化制药工艺》P?都有升血压、抗利尿、刺激子宫收缩、排乳的作用,催产素促进遗忘,加压素增强记忆。 W:WRG8(F
3.短杆菌肽和缬氨霉素 n/BoK6g
4.促甲状腺素释放因子:TRF,是个三肽,TRF→促甲状腺素→甲状腺素 fpZHE=}r
5.胰高血糖素:29肽,存在,见《生化制药工艺》P?,升高血糖,作用同肾上腺素。 Kx[+$Qt
§3.蛋白质 DH$Nz
一.种类和性质 pnuwjU-
1.种类 ^I6Vz?0Jl
<1>组成上分:简单蛋白:仅由aa构成 xrNe:Aj
结合蛋白:简单蛋白与其它生物分子的结合物,糖蛋白(共价)、脂蛋白(非共价) 6_rgRo&
<2>形态上分:球蛋白:长/宽≤3~4,血红蛋白 .W;cz8te
纤维蛋白:长/宽>10,血纤蛋白、丝蛋白 .A/xH
x
<3>功能上分:酶、抗体、运输蛋白、激素等 EN}4-P/5
<4>理化性质上分:HDL、VHDL、LDL、VLDL |,TBP@
<5>构象上分:国际上有蛋白质构象库。 >#T?]5Z'MF
2.性质 )"tM[~e`
<1>紫外吸收:280nm,贡献者是Trp、Tyr、Phe,最主要的是Trp,核酸的紫外吸收峰在260nm。 /UR;,ts
<2>两性解离:有PI,不能计算,只能测定(等电聚焦)。 "~K ph0-
等电点沉淀法:PI处蛋白质的溶解度最低。 DV({! [EP
<3>胶体性质:大分子,多于51个aa残基,最小平均分子量为5000D;在水中能两性解离故而带电,又亲水,所以是胶体,分散好。有电泳、布朗运动、丁达尔现象、不能通过半透膜等等典型的胶体性质。 7;6'=0(
<4>沉淀反应:凡是能破坏水化膜以及能中和电荷的物质均可使蛋白质沉淀 sQrM"i0Y>
等电点沉淀:PH值,中和电荷 U:
<
盐析:高浓度的盐溶液使蛋白质沉淀,离子中和电荷,如(NH4)2SO4
<ZO+e*4
盐溶:低浓度的盐溶液使蛋白质溶解,蛋清的溶解。 R:^jQ'1
有机溶剂沉淀:降低溶液的介电常数。 j@UE#I|h
<5>蛋白质变性:蛋白质在某些外界因素的影响下,理化性质改变、生物活性丧失的现象。这些因素包括热、酸、碱、有机剂等。 vQoZk,
蛋白质变性理论:吴宪,1931年提出。蛋白质的功能直接由蛋白质的构象来决定,某些外界因素改变了蛋白质的独特构象,因而使生物活性丧失。但不改变蛋白质的一级结构(即共价结构)。蛋白质的变性与水解是不同的。 ]}&HvrOld
当环境条件恢复时,蛋白质的生物活性有可能也恢复,这就是蛋白质的复性。 o=lZl_5/u;
这一理论在实践中有很重要的指导意义,能够解释酶为什么有最适的PH和最适的温度。 (A?w|/bZd
<6>蛋白质的颜色反应:可以用来定量定性测定蛋白质 =
~*Vfx
双缩脲反应:红色,λm=540nm ~e]l
黄色反应:与HNO3的反应,生成硝基苯,呈黄色。皮肤遇到HNO3的情况,白→黄→橙黄。 elD|b=(-
米伦氏反应:与HgNO3 或HgNO2的反应,呈黄色,原理同上。 z 7cA5'c
与乙醛酸的反应:红色,Trp的吲哚基的特定反应。 x'Nc
}
坂口反应:红色,Arg的胍基的反应。 G ,`]2'(@
福林反应:蓝色,是Tyr的酚基与磷钼酸和磷钨酸的反应。 y<BG-
印三酮反应:紫红色 NUtKT~V
Pauly反应:樱红色,His的咪唑基。 mSEX?so=[
二.蛋白质的一级结构及其测定 :[C|3KKe"
1.蛋白质的结构层次:1、2、超2、结构域、3、4 [*H h6
2.一级结构:即蛋白质的共价结构或平面结构,核心内容就是aa的排列顺序,它的改变涉及到蛋白质共价键的破坏和重建。 h>z5m
一级结构的全部内容包括:肽链的个数、aa的顺序、二硫键的位置、非aa成分。 +
}mj;3i
3.蛋白质一级结构的测定 [KW)z#`
*
间接法:通过测定蛋白质之基因的核苷酸顺序,用遗传密码来推断aa的顺序。这是因为核苷酸的测序比蛋白质的测序工作要更方便、更准确。 G}dq
ft5"
直接法:用酶和特异性试剂直接作用于蛋白质而测定出aa顺序。 &EC8{.7
<1>第一步:前期准备 *m'&<pg]X
分离纯化蛋白质:纯度要达到97%以上才能分析准确。 [xdVuL;N
蛋白质分子量的测定:渗透压法、凝胶电泳法(聚丙烯酰胺、SDS)、凝胶过滤法、超离心法等 .F\[AD 5
aa组成的测定:氨基酸自动分析仪 :prx:7
肽链拆分:非共价键的如氢键、离子键、疏水键、范德华力4种,可用尿素或盐酸胍等有机溶液来拆分。共价键的仅二硫键1种,可用巯基乙醇、碘代乙酸、过甲酸来拆分。 Q:ql~qew
<2>第二步:肽链的端点测定 M~9IL\J^G
N端测定:Sanger法,DNFB→DNP-肽→水解→乙醚萃取→层析鉴定 +5:9?&lH
Edman法,PITC→PTC-肽→PTH-aa→层析鉴定 _?Ly7*UML
C端测定:肼解法,P83,唯有C端aa与众不同,酰肼化合物与游离aa,再通过Sanger法来鉴定。Asn、Gln、Cys、Arg将被肼破坏,不能分析。 (;N#Gqb6l
羧肽酶法:配合动力学控制。 T7?z0DKi
羧肽酶A:Arg、Lys、Pro除外的氨基酸残基 c'bh`
H4
羧肽酶B:仅Arg、Lys JFkx=![
羧肽酶C:所有的氨基酸残基 {JfL7%
<3>每条肽链aa顺序的测定:aa顺序自动分析仪只能准确测定50aa以下的肽链,而一般的蛋白质都含有100以上的aa残基,所以,事先要将蛋白质打断成多肽甚至寡肽,再上机分析,而且要2套以上,便于以后拼接。 sv!6zJs
常用的工具酶和特异性试剂有: Kj-zEl
胰蛋白酶:仅作用于Arg、Lys的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。
Ozsv
sa
糜蛋白酶:仅作用于含苯环的氨基酸的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。 Trp、Tyr、Phe E6?0/"
CNBr:仅作用于Met的羧基与别的氨基酸的氨基之间形成的肽键。 :p$Q3
拼接:将2套多肽的aa顺序对照拼接,举例: 'SWK{t \4
156987351256984523→15 698735 125 69845 23 uPb. uG
→1569 873512569 84523 u*T#? W?
<4>第四步:二硫键位置的确定:包括链内和链间二硫键的位置,用对角线电泳来测。在肽链未拆分的情况下用胃蛋白酶水解之,可以得到被二硫键连着的多肽产物。先进行第一向电泳,将产物分开。再用过甲酸、碘代乙酸、巯基乙醇处理,将二硫键打断。最后进行第二向电泳,条件与第一向电泳完全相同。选取偏离对角线的样品(多肽或寡肽),它们就是含二硫键的片段,上机测aa顺序,根据已测出的蛋白质的aa顺序,把这些片段进行定位,就能找到二硫键的位置。如下图 ~x+&cA-0A2
4.蛋白质一级结构测定的意义 rFW,x_*_vP
<1>分子进化:将不同生物的同源蛋白质的一级结构进行比较,以人的为最高级,从而确定其它物种的进化程度,也可以制成进化树,由于这是由数据决定的,因此比形态上确定的进化更加科学和精确。 {C%f~j
<2>证明了一个理论,即蛋白质的一级结构决定高级结构,最终决定蛋白质的功能。 ,Mn`kL<F
<3>疾病的分子生物学:镰刀型贫血症的内因是血红蛋白的β6Val,正常的血红蛋白的β6Glu PD^Cj?wm
cfc=a
三.蛋白质的二级结构 byk9"QeY\
1.二级结构概论 Z..s /K{
<1>二级结构的定义:肽链主干在空间的走向。主干指的是肽平面与α-C构成的链子,见P95。 AaM~B`B
<2>二级结构的内容:空间走向以及维持这种走向的力量:氢键和R基团的影响(离子键、疏水键、空间障碍等) suN}6CI
<3>二级结构的数学描述:ф角:肽平面绕N-Cα单键旋转的角度 u)Vn7
zh
ψ角:肽平面绕Cα-C羧基单键旋转的角度,见P95。 V~QOl=`K:
至于+-方向的规定,0度角的规定太复杂,不作要求。
6'.CW4L
这样,一个肽平面的空间位置可以被2个二面角来确定,如果每个肽链的两个二面角(ф,ψ)都相同,则构成了规则的空间走向,所以可以用(ф,ψ)来描述肽链的二级结构。 75c\.=G9q<
2.二级结构的常见类型 |u[@g`Z
Pauling的贡献,X光衍射法是研究蛋白质构象的最好技术,羊毛蛋白和蚕丝蛋白,单调一致,诺贝尔化学奖。 )kE1g&
<1>α-右手螺旋 l0%7u
α-螺旋即像弹簧一样的螺旋,有右手与左手之分,自然选择蛋白质的α-螺旋为右手螺旋。示范。 F^!_!V B
α-右手螺旋的数据:每一圈含有3.6个aa残基(或肽平面),见P96的b,每一圈高5.4Å,即每一个aa残基上升1.5Å,旋转了100度,2个二面角(ф,ψ)=(-570,-480)。 T?{F7
维持α-右手螺旋的力量是链内氢键,它产生于一个肽平面的C=O与相邻一圈的在空间上邻近的另一个肽平面的N-H之间,见P96b,它的方向平行于螺旋轴,因此,α-右手螺旋的外观是个筒状的帘子,见P96c。每个氢键串起的长度为3.6个肽平面或3.6个aa残基,被氢键串起来的这个环上含有13个原子,故α-右手螺旋也被称为3.613螺旋。 |_16
IEJ
R基团对α-右手螺旋的影响:破坏者Pro,该处折断,因为亚氨基不能形成氢键;不稳定者酸性、碱性、太大、太小:Glu、Asp、Arg、Lys、Gly、Ile。其它都是起稳定作用的。 q)RTy|NJ^
分布:毛发中的α-角蛋白,例如头发中的α-角蛋白。见沈同P155。 Y>CZ
<2>β-折叠:肽链在空间的走向为锯齿折叠状,见P97。跟纤维素的相似。 #D%l;Ae
二面角(ф,ψ)=(-119℃,+113℃)。 /,+&O#SX
维持β-折叠的力量:链间的氢键,它产生于一个肽平面的C=O与相邻肽链的在空间上邻近的另一个肽平面的N-H之间,见P98,两条肽链上的肽平面互相平行,形成片层结构。见P97。 N{K[sXCW
β-折叠有平行式和反平行式两种见P98。 ,'@t.XP
平行式:两条链的走向相同,N-C (_Rl
f$D
N-C gzp]hh@4
反平行式:两条链的走向相反,N-C Ots] y
C-N .s3y^
1C
反平行式的β-折叠比平行式的更稳定 ^7Z.~A y
一条肽链回折后就可形成两条走向相反肽段,就可以形成反平行式的β-折叠,β-折叠不限于两条肽链之间,多条肽链可以形成很宽的β-折叠片层,片层与片层之间以范德华力相互作用,形成厚厚的垫子。 e Y
(JU5{
α-右手螺旋与β-折叠相比更具弹性,不易拉断,β-折叠易拉断,α-右手螺旋经加热后可变成β-折叠,长度增加,毛衣越洗越长也是这种变化。 7Dz-xM_?
<3>左手螺旋:存在于胶原蛋白中,aa残基组成为(-Gly-Pro-Y-),Y为 HyPro或HyLys靠链间氢键和范德华力来维持。见沈同P158。 28lor&Cc
<4>U型回折:也叫β-转角,肽链在某处回折1800所形成的结构。这个结构包括的长度为4个aa残基,其中的第三个为Gly,稳定该结构的力量是第一和第四个aa残基之间形成的氢键。在黑板上演示。 (q=),3/<pU
<5>310螺旋:是α-右手螺旋的过渡形式,又廋又长,每个氢键串起的长度为3个肽平面或3.6个aa残基,被氢键串起来的这个环上含有10原子。 =la~D]T*g
<6>无规卷曲:无固定的走向,但也不是任意变动的,它的2个二面角(ф,ψ)有个变化范围。 j$r2=~1
从结构的稳定性上看α-右手螺旋>β-折叠> U型回折>无规卷曲,而从功能上看正好相反,酶与蛋白质的活性中心通常由无规卷曲充当,α-右手螺旋和β-折叠一般只起支持作用。 B{7hRk.5!
3.超二级结构:空间相邻的几个2级结构形成的更复杂的结构,其类型有 !4T7@V`G
<1>左手超螺旋:3根α-右手螺旋拧到一起形成一个左手超螺旋,如头发中的角蛋白,见沈同P155。 xDn#=%~+x
<2>右手超螺旋:3根左手螺旋拧到一起形成一个右手超螺旋,如胶原蛋白,见沈同P158。本教材P103有误。 )/BbASO$)Z
<3>αα:相邻的2根α-右手螺旋拧到一起形成一个左手超螺旋,见P98。 ev z@c)8
<4>β×β:一个连接链连着2个β折叠,平行式,这个连接链可以很长。见P98。 -~^sSLrbP
<5>βαβ:3段β折叠和2段α螺旋相间形成,见P98。 WI-I+0sE
<6>βββ:以2段U-型回折连接着的3段β折叠,反平行式。见P98。 =dY!-#yg!
4.结构域:长肽链(多于150个aa),在二级结构的基础上通过多次折叠,在空间上形成一些半独立的球状结构,叫结构域,它是三级结构的一部分,结构域之间靠无规卷曲连接。也就是说将三级结构拆开后首先看到的结构。草图显示。 1raq;^e9
四.蛋白质的三级结构和四级结构 X 3(*bj>P
1.三级结构:即蛋白质的三维结构、构象,指其中所有原子的空间排布,是结构域再经过卷曲和折叠后形成的。如果蛋白质是单条肽链,则三级结构就是它的最高级结构,三级结构由二硫键和次级键(氢键、疏水键、离子键、范德华力)维持。P99是肌红蛋白的三级结构。 Mo[
yRRS#
2.四级结构:多条肽链通过非共价键(氢键、疏水键、离子键、范德华力)形成的聚合体的结构就是四级结构,注意,由二硫键连接的几条肽链不具有四级结构。每条肽链都有自己的三级结构,称为亚基或亚单位,一般情况下,具有四级结构的蛋白质含有的肽链不会太多,故称这类蛋白质为寡聚蛋白,如寡聚酶等。 ??,/85lM
五.蛋白质的结构与功能 =$\9t $A
1.蛋白质的结构与功能的关系 %G'P!xQhy
<1>每一种蛋白质都具有特定的结构,也具有特定的功能。 ;~( yv|f6
<2>蛋白质的结构决定了蛋白质的功能。 $Sd pF-'
<3>蛋白质的功能直接由其高级结构(构象)决定。例子,蛋白质的变性现象。 hWRr#030
<4>蛋白质的一级结构决定高级结构(构象),因此,最终决定了蛋白质的功能。例子,人工合成胰岛素,A、B链分别合成,等比例混合后就有活性。而生物合成胰岛素则是先合成一条长肽链,形成正确的二硫键,而后再剪去中间的C肽才形成胰岛素的。草图显示。 p4z
thdN[
2.蛋白质结构与功能实例 +*x9$LSD
<1>免疫球蛋白G:即抗体G,IgG(Immuno globe),由免疫细胞B分泌出的蛋白质,可以特异的结合抗原并消灭之,这就是免疫反应。 f^G-ba
IgG的一级结构:四条肽链,2重2轻(L2H2),对称排列,LHHL,有12条链内二硫键,4条链间二硫键,见草图。对其aa的分析发现,IgG分为V区(可变区)和C区(恒定区)。 N)
二级结构:几乎全是β折叠,由无规卷曲连接。 1n~^@f#`
结构域:有12个球体,每个均被二硫键锁住。 C{]1+eL
三级结构:T型和Y型,属于球蛋白。 *)s^+F 0
没有四级结构。 Fq'Ds[wd5
IgG的功能:V区负责结合抗原,像钳子一样夹住抗原,体现了IgG的特异性,2价。C区负责结合补体(一种酶,可以水解抗原),也是2价,结合部位在寡糖链处的铰链区。IgG的动态作用过程用人体演示。 "$A5:1;
<2>肌红蛋白:Mb(Myoglobin),哺乳动物的肌肉中储存氧气的蛋白质,水生的哺乳动物体内尤为发达(如鲸鱼),因此,它们可以憋气很长时间,研究用Mb一般由鲸鱼提供。 fY!9i5@'
一级结构:单条肽链,153个aa,其中的83个aa为保守序列(即同源蛋白质均相同,是决定功能的最重要序列),含有一分子血红素辅基,见P104,其中保持Fe2+,血红素通过Fe2+以配位键吊在肽链的His的咪唑基上,示意。O2将结合在Fe2+上。 ) RNB;K~s9
二级结构:几乎全是α-右手螺旋,中间由无规卷曲和结来连接。 $ <Mf#.8%
三级结构:扁平的菱形,见P99或沈同P172,属于球蛋白。 ?$ M:
4mX
功能:储存氧气。其三级结构在分子表面形成一个疏水的空穴,血红素即藏在其中,该空穴允许O2进入而拒绝水的进入,保证了Fe2+结合O2而避免了Fe2+→Fe3+。 ;1q|SmF
Mb结合氧气的特征可以由氧合曲线来描述,见P104,为双曲线形。其中的氧饱和度(饱和百分数)为Mb O2/(Mb O2+ Mb),P O2为氧的分压。从图中可以看出,Mb倾向于结合氧气而不愿意放出氧气,所以它的功能是储存氧气,只有在P O2极低的时候(体内缺氧的时候)它才释放出氧气。另外,C O可以与O2竞争性的结合Mb。 S%df'bh$
<3>血红蛋白:Hb(Hemoglobin),在人体中有三种,HbA,HbA 2,HbF(仅存于胎儿中),三者的结构和功能大同小异,此处以HbA为例。 `pfRY!
一级结构:4条链,α2β2。α141,β146,每条肽链都结合着一分子的血红素,两条β链之间还夹着一分子DPG(二磷酸甘油酸),每条肽链都有保守序列。 O[ F
二级结构:4条链均同Mb, 几乎全是α-右手螺旋,中间由无规卷曲和结来连接。 Oe lf^&m
三级结构:4条链均同同Mb, 扁平的菱形,见沈同P181,属于球蛋白。 nRs:^Q~o
四级结构:4个亚基占据着4面体的4个角,链间以离子键结合,一条α链与一条β链形成二聚体,Hb可以看成是由2个二聚体组成的(αβ)2,在二聚体内结合紧密,在二聚体之间结合疏松。 6bT>
x5?
功能:运输氧气,4价。其三级结构在每个肽链的分子表面形成一个疏水的空穴,血红素即藏在其中,该空穴允许O2进入而拒绝水的进入,保证了Fe2+结合O2而避免了Fe2+→Fe3+。 ,iXQ"):!OB
其氧合曲线见P104,为S形曲线,只有在PO2很高的情况下(在肺部)Hb才结合氧气,而PO2一降低(在外周血管中),它就释放O2,而此时的Mb却纹丝不动。就结合O2的能力而言,4价的Hb还不如1价的Mb。 lg*?w/JX+
Hb的氧合曲线形状与Mb不同是因为它有着Mb所不具有的一些特性,如: 5 TLE%#G@+
协同效应:Hb分子中一条链结合O2后,可以导致其构象的变化,使其它几条链结合O2的结合能力突然增强,表现出其氧合曲线为S形曲线。对Hb协同效应的解释为:在没有结合氧气时,Hb的四条链之间结合紧密,这种构象称为T态,这种紧密是由离子键和DPG(位于2条β链之间)造成的,屏蔽了分子表面疏水的空穴,使Hb分子结合O2的能力降低(游离的α链和β链结合氧气的能力与Mb相同)。当一条链结合了氧气之后,铁卟啉把His的咪唑基向下一扯,导致该肽链的三级结构发生变化(牵一发而动全局),肽链之间的离子键被破坏,Hb的四级结构也随之改变,2个二聚体(αβ)之间发生错位,挤出DPG,四级结构进一步变化,每条链表面疏水的空穴暴露在外,这种构象称为R态,结合氧气的能力得以增强。 D_ XOYzN}
别构效应:是某些寡聚蛋白质特有的现象。是指蛋白质与效应物结合改变蛋白质的构象,进而改变蛋白质的生物活性。 W6V((84(O
Hb的活性中心:Hb每个亚基上血红素存在的那个疏水空穴是结合氧气的地方,称之为活性中心,也叫活性部位。 >~ L0M
别构中心:在Hb分子的其它地方还有结合效应物的部位,如结合H+、CO2、DPG甚至O2,这些部位结合了效应物之后,可以改变蛋白质的构象,进而影响到活性中心与氧气的结合,这些部位就叫别构中心。活性中心与别构中心可以重合也可以不重合,在Hb中是不重合的。 uj+{
tc
因此,别构效应可以说成是别构中心结合了效应物之后影响了活性中心与氧气的结合。协同效应实际上就是一种别构效应。Mb只有活性中心没有别构中心,它的氧合曲线就是双曲线形的。 |mT1\O2a
Hb的另一个别构效应是波尔效应:H+和CO2对Hb与氧气结合的影响。具体的影响见P105的方程式,叙述为H+和CO2促进Hb释放O2,这也解释了Hb为什么在肺中吸氧排CO2,而在肌肉中吸CO2排氧。 t\f[->f
另外,DPG降低Hb与O2的结合能力。 EF'8-*
关于镰刀形细胞贫血症:红细胞减少,只有正常人的1/2,无力,剧烈运动会导致死亡。Hbs与Hb在结合O2的能力方面并没有区别,区别在于Hbs造成红细胞溶血,溶血后的Hb不能像红细胞中的Hb一样正常运输O2。Hbs导致溶血的原因在于其β6Val,正常的血红蛋白的β6Glu,红细胞表面的Hbs由于疏水键而聚集,使细胞膜破裂。 2Q;rSe._`
镰刀形细胞贫血症在非洲某些地区居然是自然选择的结果,是与疟疾抗争的产物。 5aNvGI1
Hbs纯合子:β6Valβ6Val Hbs杂合子:β6Gluβ6Val 正常人β6Gluβ6Glu C]Q}HI#G
童年死,抗疟疾 死亡分布年龄广,抗疟疾 长寿,一得疟疾立即死 ?*'0;K13
疟疾杆菌只能利用正常人的Hb,不能利用Hbs,所以Hbs者是不感染疟疾的。在该地,Hbs纯合子和正常人都经不起自然选择,只有Hbs杂合子存活了下来 9K-,#a
RSCQ`.
六.多肽的固相合成 0rxGb} b*
1.多肽的液相合成:aa1-aa2-aa3-aa4-aa5 3!`
_Q%
aa1+aa2→aa1-aa2+aa2-aa1+aa1+aa2,得率很低而且分离出2肽aa1-aa2很烦,合成越到后面,分离工作越困难。 ahFK^ #s
2.经过保护和活化处理的多肽的液相合成: 15d'
/f
保护氨基aa1活化羧基+aa2保护羧基→ 3 6t^iV*3
保护氨基aa1 -aa2保护羧基+保护氨基aa1活化羧基+aa2保护羧基 <,Mf[R2N>
分离2肽“保护氨基aa1 -aa2保护羧基”,去掉氨基保护,再与“保护氨基aa3活化羧基”反应。 C$4{'J-ZH
得率提高,分离简化,但仍然很烦。 Y++n0sK5<
3.多肽的固相合成:主要就是解决了分离提取方面的难题。 1p=bpJC
整个过程见草图,其中□表示保护,△表示活化,合成的方向为C→N,与生物合成多肽的方向相反。 Q=Liy@/+!
多肽的固相合成思路诞生于洛克菲勒大学主教学楼的电梯中,该大学的教授、诺贝尔奖金获得者与其老板洛克菲勒的一段对话。因此,现在人们还能在电梯的内壁上看到“Solid-phase peptide synthesize was born here!” oA3;P]~[
V!NRBXg
#Y'ewu;qJ
布置本章作业: O^@F?CG :1
1.用下列实验数据推导某肽链的一级结构: ZO>)GR2S
<1>完全酸水解后产生的aa组成为:Ala、Arg、2Ser、Lys、Phe、Met、Pro @WiTh'w0
<2>用DNFB处理并水解得到DNP-Ala和ε-DNP-Lys \"w+4}
<3>羧肽酶A和B都对此肽不作用 M>xT\
<4>用CNBr处理获得2个片段,其中一个片段含有Pro、Trp、Ser 8Wgzca
Q*
<5>用糜蛋白酶作用产生3个片段,1个含有Pro、Ser;另1个含有Met、Trp;最后一个含有Phe、Lys、Ser、Ala、Arg )TEod!]
<6>用胰蛋白酶处理产生3个片段,1个含有Ala、Arg;另1个含有Lys、Ser;最后一个含有Phe、Trp、Met、Ser、Pro k{U[ U1j
2.根据书上P59给出的PK’值,计算正常的二肽Glu-Lys以及Lys-Glu的PI值。 E6M*o+Y
若有时间就介绍一下参考书。见本讲义P2 Q\N >W+d
第五章 酶 $k`j";8uR
§1.酶的概论 u"m TS&
一.酶是生物催化剂 A5Q4wy`
二.酶的特点 6OqF-nso[E
1.效率高:用转换数来衡量,即每个酶分子每秒钟催化底物的量(uM),比其它催化剂高出107~1013倍。 8dCRS
U
2.具有专一性:每一种酶只能作用与一种或一类相似的物质,称为底物。专一性表现在对某一种键的催化上(如水解糖苷键、肽键),高度专一性的酶不仅对化学键有要求,对该键两侧的基团也有要求(胰蛋白酶),甚至对基团的构型也有严格要求(体内所有蛋白质合成或分解的酶都只认L型AA) ^m
AxV7k
3.条件温和:室温、常压、温和的PH,剧烈条件反而使酶失活。对比蛋白质的酸碱水解。 6cD3(//
三.酶的化学本质 \:+ NVIN
1.是蛋白质:酶的性质符合蛋白质的特性,为主,80年代以前的书籍都认为酶的本质就是蛋白质。 .`(YCn?\
2.是RNA:新发现的某些酶的成分是RNA,称为核糖酶。 &WOm[]Q4
对比而言,蛋白质作为的酶种类多,数量大,效率高,是酶中的主力。核糖酶仅限于水解酶类,且效率低。 Zr =B8wuT
四.酶的分类 C|[x],JCS
1.按组成成分分: Ya(3Z_f+VZ
简单蛋白质:只有蛋白质成分。 /1$u|Gs
*
结合蛋白质:蛋白质+非蛋白成分=全酶,蛋白质部分称为酶蛋白。 U@D\+T0
非蛋白成分称为辅酶:与酶蛋白结合疏松 6ND*L0
或辅基:与酶蛋白结合紧密 ]9c{qm}y
通过透析可以鉴别两者。 s_^N=3Si
2.按分子结构分: <4~SFTWY
单体酶:酶蛋白只是一条单肽链,如胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶等。 'Gamb+[
寡聚酶:酶蛋白是具有4级结构的蛋白质,有几条~几十条彼此非共价连接的肽链,如糖原磷酸化酶等。这种酶便于进行调节。 @(+\*]?^&
多酶体系:由几种独立的酶彼此结合形成的聚合体,后一种酶的底物正好是前一种酶的产物,多酶体系的效率极高,很像是流水作业。 e+:X%a4\
3.按反应性质分:6大类,很重要。 72_+ b
<1>氧化还原酶类:催化氧化还原反应的酶,以催化脱氢为主加氧为次(包括其逆反应:就是加氢脱氧)。用方程式表示就是:A·2H + B ←→ A + B·2H Db;>MWt+e
这类酶通常都需要辅酶帮忙,辅酶有下列几种:NAD(尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NADP(尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)、FMN(黄素腺嘌呤单核苷酸),这些都是维生素的衍生物。 *ae)<l3v
具体例子:乳酸发酵的最后一步,见草图。 s,AJR
[
<2>转移酶类(移换酶类):催化基团转移反应的,用方程式表示为:AB + CD ←→ AC + BD yu&mu